12000rpm离心lmin。加2 μ 1的RNase抑制剂。混匀后置-80°C待用。
[0048] (2)基孔肯雅恢复病毒RNA的RT-PCR扩增和序列测定
[0049] 以反转录引物 R-11777(序列为 5'-TTTGTGTGGTTTCGAAATCGT-3'，SEQ ID NO :5) 制备基孔肯雅恢复病毒R-CHIKV基因组的cDNA。反转录反应的组分如下：R-CHIKV基因组 RNA 15 μ 1 ;R-11777(10 μΜ) 1. 25 μ 1 ;dNTP(2. 5mM each) 10 μ 1 ;水（不含 RNase)6. 25 μ 1〇 将上述反应组分混合均勾，置65°C下5min，冰浴2min。补加如下组分：5Xfirst_strand ^1打61104 1;001'(0.11111)2.54 1;尺似86抑制剂2.54 1;5即6『5(^1口七1112.54 1。551€ 下 60min ;70°C下 15min。加 1 μ l(2U)RNase H，37°C下 20min。-20°C保存待用。
[0050] 用获得的cDNA作为模板，用LA Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司产品）进行PCR扩 增。所用上下游引物分别为 CHIKV-F6(5' -GACAATGGCAGAAGGAATTTC-3'，SEQ ID N0:6)和 CHIKV-R6(5'-TGTGTGTCGCCCCGTCGTCTA-3'，SEQ ID N0:7)。上述引物扩增基孔肯雅病毒的 非结构蛋白编码区。PCR反应体系组成如下：10XLA Buffer 5μ1 ;上游引物（10μΜ)2μ1 ; 下游引物（1〇μΜ)2μ1 ;dNTP(2.5mM each)8yl ;cDNA 3μ1 ;LA Taq DNA聚合酶0·5μ1 ;水 29. 5 μ 1。反应条件如下：94°C变性 4min，94°C 30s、60°C退火 30s、72°C延伸 3min 50s，30 个 循环，再置于72°C下10min。1 %琼脂糖凝胶检测PCR产物长度，用PCR纯化试剂盒回收所 得的PCR片段并测序。琼脂糖凝胶的检测结果显示，以恢复病毒cDNA，野生型病毒cDNA以 及全长感染性克隆质粒为模板，均可以扩增获得大小约为1200bp的特异的DNA片段，与预 期一致（如图2所示）。测序的结果也显示，上述片段为基孔肯雅病毒的非结构蛋白特异的 编码区。这些结果表明，所获得的恢复病毒含有基孔肯雅病毒特异的基因序列。
[0051] 测试例2
[0052] 本测试例用来说明基孔肯雅恢复病毒的致细胞病变效应。
[0053] 将基孔肯雅恢复病毒种子液R-CHIKV以及基孔肯雅野生型病毒⑶05/2010株 (CHIKV-GD05/2010)分别接种于铺于6孔板的单层BHK-21细胞（汇合度为90% )。吸附 lh后，移去病毒液，弃去病毒液，添加含2体积％的FBS的DMEM培养基，置于37°C、5% C02 的孵箱中培养。每天观察细胞形态的变化。结果显示，BHK-21细胞在感染恢复病毒或野生 型病毒后的第3天均出现细胞圆缩、裂解和脱落（如图3所示）。这表明恢复病毒能够使敏 感细胞产生细胞病变，病变进程与野生型病毒相似。
[0054] 测试例3
[0055] 本测试例用来说明基孔肯雅恢复病毒的空斑形态。
[0056] 用2%的FBS的DMEM将病毒种子液以10倍比稀释为10 4,以500 μ 1/孔接种于铺 于6孔板的单层ΒΗΚ-21细胞（汇合度为90% )。吸附2h后，弃去病毒液，添加含有DMEM培 养基（含2体积^^FBS)的1% (lg/100mL)的琼脂盖，置于37°(：、5%0)2的孵箱中培养。 3天后用4%甲醛室温固定lh，弃琼脂盖，结晶紫室温染色lOmin，观察空斑形态。以相同方 法对基孔肯雅野生型病毒⑶05/2010株的空斑进行分析。空斑试验的结果如图4所示，基 孔肯雅恢复病毒和野生型病毒均能形成大小均一，边缘清晰的空斑。上述结果表明，基孔肯 雅恢复病毒与野生型病毒具有相似的增殖特征。
[0057] 从以上测试例的结果可以看出，本发明的DNA分子或重组质粒能够用于拯救获得 与野生型病毒相近的基孔肯雅病毒。
[0058] 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0059] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0060] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种包含基孔肯雅病毒全基因组cDNA的DNA分子，其特征在于，该DNA分子的核苷 酸序列如SEQIDNO:1所示。2. -种重组质粒，其特征在于，该重组质粒含有SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的重组质粒，其中，所述重组质粒为在质粒pUC18的SbfI酶切 位点和SapI酶切位点之间依次连接有启动子序列、SEQIDNO:1所示的核苷酸序列、多聚 腺苷酸序列以及选择性含有的用于PCR鉴定的特异序列的重组质粒。4. 根据权利要求3所述的重组质粒，其中，所述启动子为Sp6启动子。5. 根据权利要求3或4所述的重组质粒，其中，用于PCR鉴定的特异序列如SEQIDNO: 3所示。6. -种构建重组质粒的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 通过化学合成法获得DNA片段F1和DNA片段F2,其中，DNA片段F1的序列由启动 子序列和SEQIDNO:1第1-7733位核苷酸所示的序列组成，DNA片段F2的序列由SEQID NO:1第7310-11774位核苷酸所示的序列、多聚腺苷酸序列和选择性含有的用于PCR鉴定 的特异序列组成； (2)使用SbfI和SapI对DNA片段F1进行酶切，从而将酶切后的DNA片段F1插入 质粒PUC18的SbfI酶切位点和SapI酶切位点之间，得到pUC18-5,使用SbfI和SapI 对DNA片段F2进行酶切，从而将酶切后的DNA片段F2插入质粒pUC18的SbfI酶切位点 和SapI酶切位点之间，得到pUC18-3 ; ⑶使用BssHII和SapI对pUC18-5和pUC18-3进行酶切，进一步连接酶切所得的大 片段，得到重组质粒pCHIKV-FL。7. -种基孔肯雅病毒的感染性克隆，其特征在于，该感染性克隆的基因组RNA对应的 cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。8. -种构建基孔肯雅病毒的感染性克隆的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求 2-5中任意一项所述的重组质粒进行体外转录，将得到的转录体RNA转染敏感细胞。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述敏感细胞为BHK-21细胞。10. -种标记基孔肯雅病毒DRDE-06株的方法，其特征在于，该方法包括将基孔肯雅病 毒DRDE-06株基因组RNA对应的cDNA的第7522-7523位核苷酸由TT突变为GG。
【专利摘要】本发明公开了一种核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示的DNA分子及其用途，包括标记基孔肯雅病毒DRDE-06株的方法、含有该DNA分子的重组质粒及其构建方法、基因组RNA对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示的基孔肯雅病毒的感染性克隆及其构建方法。本发明的DNA分子或重组质粒能够用于构建性能与野生型病毒相近的基孔肯雅病毒的感染性克隆。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12N7/01, C12N15/66, C12N15/34, C12Q1/70, C12N15/63
【公开号】CN105483139
【申请号】CN201410471749
【发明人】李晓峰, 秦成峰, 邓永强, 姜涛
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月16日