一种包含基孔肯雅病毒全基因组cDNA的DNA分子及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA分子及其用途，具体地，涉及一种包含基孔肯雅病毒全基因 组cDNA的DNA分子、标记基孔肯雅病毒DRDE-06株的方法、含有该DNA分子的重组质粒及 其构建方法、基孔肯雅病毒的感染性克隆及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV)属于披膜病毒科（Togaviridae)甲病 毒属（Alphavirus)，该属的成员还包括罗斯河病毒（Ross River viruses)，塞姆利基森林 病毒（Semliki forest virus)和辛德毕斯病毒（Sindbis virus)等。CHIKV的主要传播媒 介是埃及伊蚊（Aedes aegypti)和白纹伊蚊（Ae. albopictus)，可导致基孔肯雅热，其发病 特征表现为发热，肌肉痛和关节痛。尽管基孔肯雅热的死亡率较低，但是近50年来其传播 范围迅速扩大，已经由起初流行的东非地区迅速传播至欧洲、亚洲和大洋洲地区。特别是东 南亚地区的印度，印度尼西亚，泰国和越南等国家，近10年来屡有基孔肯雅热的爆发流行。 我国在2006-2008年间仅有散发的输入性病例的报道，但是2010年广东东莞地区爆发了一 次小规模的基孔肯雅热疫情。因此，基孔肯雅热已成为一种严重威胁人类健康的再发传染 病，但是目前仍然无有效的治疗药物和预防用疫苗。
[0003] CHIKV是一种包膜病毒，基因组是长度约为12 kb的单股正链RNA，含有两个读码 框，分别编码3个结构蛋白（衣壳蛋白C、包膜蛋白E1和E2)和4个非结构蛋白（nsPl-4)。 RNA病毒的全长感染性cDNA克隆经体外转录后可获得具有感染性的病毒RNA，再转染细胞 后获得拯救病毒。这极大方便了我们对病毒基因组序列进行定向改造，从而获得具有新性 状的突变病毒。通过比较野生病毒与突变病毒生物学性质的变化，可以确定病毒关键的毒 力位点，筛选出病毒关键的抗原表位，为疫苗设计提供靶点。因此，病毒的感染性全长cDNA 克隆是深入研究病毒复制及致病机制的基础。
[0004] 合成生物学的基本原理是通过基因组数据库获得拟合成的目的基因信息，再采用 体外化学合成的方法获得相应的基因序列，进而将其导入特定细胞或组织中，最终拯救获 得具有生物学活性的生命体。合成生物学为病毒的感染性克隆的构建方法开辟了新的方 向，如通过全基因合成的方法获得了造成1918年大流感病毒株的基因组序列，并成功拯救 出具有生物学活性的流感病毒，有力地推动了流感病毒的生物学性质的研究。
[0005] 通过化学合成方法获得一个生命体的基因序列已成为目前生命科学领域的研究 热点，极大地方便研究生命本质的同时，也带来了许多问题。人工合成一个自然界并不存在 的全新序列，其生物学性质不得而知，生物安全性评价亟待解决。一旦发生生物泄漏事故， 如何区分人工合成序列与自然进化的序列就显得尤为重要，因此获取有效的区分方法意义 重大。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种突变的基孔肯雅病毒基因组cDNA，从而获得能够与野生 的基孔肯雅病毒相区分的感染性克隆。
[0007] 为了区分人工合成和自然进化的生物基因序列，本发明的发明人进行了大量实 验，结果发现，在特定位点引入了两个核苷酸突变（第7522-7523位突变为TT)，不会影响病 毒的感染性等特征。进一步通过序列比对发现，上述突变在自然进化的序列中均未出现，因 此是区分人工合成和自然进化的标签，便于对该序列生物安全性的评价。
[0008] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种包含基孔肯雅病毒全基因 组cDNA的DNA分子，该DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。本发明提供的DNA分 子可用作基孔肯雅病毒的基因组感染性全长cDNA克隆，且能够获得感染性与野生病毒相 当的基孔肯雅病毒。
[0009] 第二方面，本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒含有SEQ ID N0 :1所示的核苷 酸序列。
[0010] 所述重组质粒可以包括启动子等元件，根据本发明优选的实施方式，所述重组质 粒为在质粒PUC18的Sbf I酶切位点和Sap I酶切位点之间依次连接有启动子序列、SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列、多聚腺苷酸序列以及选择性含有的用于PCR鉴定的特异序列 的重组质粒。
[0011] 更优选地，所述启动子为Sp6启动子（序列为5'-GATTCCAATCTCGAGATTTAGGTGACA CTATAG-3'，SEQ ID NO :2)。
[0012] 用于PCR鉴定的特异序列是方便PCR检测的一段序列，属于重组质粒 中选择性含有的序列，进一步优选地，用于PCR鉴定的特异序列如SEQ ID N0 : 3(5' -CCTCGACTGTGCCTTCTAAAT-3'）所示。
[0013] 所述多聚腺苷酸序列可以为常规的多聚腺苷酸序列，如SEQ ID N0:4(5'-AAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAT-3'）所示的序列 。
[0014] 第三方面，本发明提供了一种构建重组质粒的方法，如图1所示，该方法包括以下 步骤：
[0015] (1)通过化学合成法获得DNA片段F1和DNA片段F2,其中，DNA片段F1的序列由 启动子序列和SEQ ID N0 :1第1-7733位核苷酸所示的序列组成，DNA片段F2的序列由SEQ ID N0 :1第7310-11774位核苷酸所示的序列、多聚腺苷酸序列和选择性含有的用于PCR鉴 定的特异序列组成；
[0016] (2)使用Sbf I和Sap I对DNA片段F1进行酶切，从而将酶切后的DNA片段F1插 入质粒PUC18的Sbf I酶切位点和Sap I酶切位点之间，得到pUC18-5,使用Sbf I和Sap I对DNA片段F2进行酶切，从而将酶切后的DNA片段F2插入质粒pUC18的Sbf I酶切位点 和Sap I酶切位点之间，得到pUC18-3 ;
[0017] (3)使用BssH II和Sap I对pUC18-5和pUC18-3进行酶切，进一步连接酶切所 得的大片段，得到重组质粒PCHIKV-FL。本发明的重组质粒pCHIKV-FL中，在质粒pUC18的 Sbf I酶切位点和Sap I酶切位点之间依次连接有启动子序列、SEQ ID N0 :1所示的核苷酸 序列、多聚腺苷酸序列以及选择性含有的用于PCR鉴定的特异序列。
[0018] 其中，启动子序列、多聚腺苷酸序列以及用于PCR鉴定的特异序列的具体选择如 前所述。化学合成DNA片段的方法包括液相合成法和固相合成法，通常可委托专门的公司 (如上海英骏生物技术有限公司）进行合成，在此不再赘述。通过酶切法在质粒的特定酶切 位点之间插入目的片段的具体操作步骤为本领域技术人员所熟知，在此也不再赘述。
[0019] 第四方面，本发明提供了一种基孔肯雅病毒的感染性克隆，该感染性克隆的基因 组RNA对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0020] 第五方面，本发明提供了一种构建基孔肯雅病毒的感染性克隆的方法，该方法包 括将第二方面所述的重组质粒进行体外转录，将得到的转录体RNA转染敏感细胞。优选地， 所述敏感细胞为BHK-21细胞。
[0021] 第六方面，本发明提供了一种标记基孔肯雅病毒DRDE-06株的方法，该方法包 括将基孔肯雅病毒DRDE-06株基因组RNA对应的cDNA的第7522-7523位核苷酸由TT 突变为 GG。基孔肯雅病毒 DRDE-06 株已在"Santhosh，S.R. et al, Comparative full genome analysis revealed El:A226V shift in 2007 Indian Chikungunya virus isolates，Virus Res. 135(1) :36-41 (2008)" 中公开。
[0022] 本发明具有如下优势：
[0023] (1)本发明基于化学合成技术构建了基孔肯雅病毒全长感染性cDNA克隆