在无细胞生物合成系统中对代谢通量的控制的利记博彩app
【专利说明】在无细胞生物合成系统中对代谢通量的控制
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35 U. S. C. § 119(e)要求2013年6月5日提交的美国临时专利申请 U. S. S. N. 61/831，376的优先权，其通过提述并入本文。 发明领域
[0003] 通过合成酶促途径在微生物宿主中生产化学品已经证明对许多重要种类的分子 有用，包括类异戊二烯，聚酮化合物，非核糖体肽，生物塑料和化学构建模块。由于生物信息 的内在模块性，合成生物学拥有巨大的潜力将这一微生物生产的化合物列表进一步扩展。 然而在宿主细胞的代谢网络中植入新的生物化学途径可能破坏细胞已经进化了几千年的 精妙的调节机制。的确，化合物的最终产出通常被对工程化的细胞的代谢的有害影响限制， 由于对细胞中发生的复杂的相互作用的理解有限，难以预测所述有害影响。对细胞资源不 受调节的消耗，异源蛋白生产的代谢负担，以及对宿主细胞抑制性或毒性的途径中间物/ 产物的积累都是可能限制总体产出的显著问题。
[0004] 已出现了代谢工程的概念来实现这一目的，其可以定义为对代谢和细胞网络有目 的的修饰，通过采用多种实验技术来达到所需的目标。将代谢工程从遗传工程和菌株改良 区分的是，它将代谢和其它细胞网络作为整体考虑来鉴定待工程化的靶标。在这个意义上， 代谢通量是代谢工程的实施中的一个基本概念。虽然细胞中的基因表达水平和蛋白以及代 谢物的浓度可以提供代谢网络状态的线索，由于缺乏这些细胞组分之间相关性的信息，它 们在充分描述细胞表型中具有内在的限制。代谢通量代表了代谢途径中的反应速率，并用 来通过数学框架整合这些因素。因此，可以将代谢通量考虑为一种代表作为多种细胞组分 之间相互作用的结果的细胞表型的方式；观察到的代谢通量概貌反应了相互联系的转录， 翻译，以及合并复杂调节的酶反应的结果。
[0005] 无细胞合成可以提供胜过体内生产方法的优势。无细胞系统可以指导细胞的大多 数（如果不是全部）代谢资源朝向一个途径的独占产物。此外，体外细胞壁的缺失是有利 的，因为它允许对合成环境的控制。
[0006] 由于大多数生物体的环境不断变化，代谢反应被精细的调节以维持细胞内的稳态 条件。通过调节途径内酶的活性控制代谢途径，通过改变所述蛋白的活性，例如，通过变构 抑制等等；以及通过改变所述酶的表达或翻译以及其稳定性；即，其有效寿命。也通过改变 细胞中存在的底物或辅因子的浓度调节途径。
[0007] 影响通过途径的通量的分子有辅酶，包括ATP。该核苷酸用于在不同的化学反应之 间转移化学能，并在磷酸化反应中作为磷酸基团的载体。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)，一 种维生素 B3(烟酸）的衍生物，是一种作为电子载体的重要辅酶。其以两种相关的形式存 在于细胞中，NADH和NADPH。多种单独类型的脱氢酶从它们的底物移除电子并将NAD+还原 为NADH。然后该辅酶的这一还原形式是细胞中需要还原它们的底物的任意还原酶的底物。
[0008] 多种酶促反应是氧化还原反应，其中一种化合物被氧化而另一种化合物被还原。 生物体进行氧化还原反应的能力依赖于环境的氧化还原（redox)状态，或其还原电位。虽 然有些时候通过单个度量表示，更有用的分析将检查重要的氧化还原剂的氧化还原状态， 特别是NAD+和NADP+辅酶。接着具体的氧化还原（或者电子转移）酶的存在和活性将决 定不同氧化还原剂的相对氧化还原状态。例如，酶谷胱甘肽还原酶催化电子从NADPH转移 至氧化谷胱甘肽以形成还原的谷胱甘肽和NADP+。取决于反应的速率和其它因素，NADPH/ NAD+对的氧化还原状态可以与氧化的/还原的谷胱甘肽对的氧化还原状态近似相同或不 相等。虽然活细胞已经形成了许多策略以紧密的调节不同的这些氧化还原对的细胞内氧化 还原状态，通过调节途径和氧化还原缓冲物，例如，谷胱甘肽和/或抗坏血酸盐，无细胞系 统可能要求工程化来提供这些调节并对于这些工程化和控制特别适合。
[0009] 为了优化影响系统性能的条件，期望操纵在无细胞生物合成反应期间影响关键代 谢物和途径的代谢通量率的参数，这些参数可能反应了通过不同途径的碳源（例如葡萄 糖）利用之间的平衡，并且也可以相对NADH和NADPH产生优化ATP产生。本发明解决了这 一问题。
[0010] 发明概述
[0011] 提供了用于在无细胞系统中，在生物合成感兴趣的途径的期望产物期间监控和控 制代谢通量率的组合物和方法，所述无细胞系统包含复杂的酶组。本发明的方法监控中心 代谢的关键代谢参数，这些参数可以包括但不限于，NADP (H) ;NAD (H) ;ATP ;核酮糖-5-磷酸 的浓度；碳源例如葡萄糖的消耗；以及CV消耗。对于感兴趣的途径，确定一种或多种代谢参 数的期望的目标水平，例如通过经验性筛选方法，或从已知的代谢途径方程推导。通过在生 物合成期间监控无细胞系统的这些关键代谢参数，并确定从期望水平的偏离，获得关于所 述系统的代谢状态的信息。基于该测量调整代谢性能，通过包括以下项的一个或多个步骤 实施：（i)在所述无细胞系统中改变酶水平；（ii)改变底物的供给速率，所述底物控制到所 述无细胞系统的氧化还原通量或碳通量；（iii)改变添加到所述无细胞系统的O 2; (iv)通 过改变跨膜泄露，控制电子传递系统的效率；其中感兴趣途径中存在的酶催化所述期望产 物的产生。
[0012] 本发明的方法的一些感兴趣的关键代谢参数涉及中心代谢，包括糖酵解和戊糖旁 路的途径；氧化磷酸化；以及氧化还原通量，例如NAD，NADH，NADP和NADPH之间，例如如图 1中图解。
[0013] 可以采用各种方法改变代谢通量率。在一些实施方案中，向反应混合物提供所需 的涉及氧化还原通量途径的外源酶，以达到期望的氧化还原平衡，所述酶以蛋白的形式或 以所述蛋白的编码序列的形式。在其他实施方案中，为了提供对于所述反应优化的起始条 件，遗传修饰在起始反应混合物中利用的微生物细胞以改变酶的表达和/或组成，所述酶 涉及氧化还原通量途径。在其它实施方案中，工程化靶标酶以包含蛋白水解切割的独特识 别序列，使得如果必要酶活性可以容易的降低。由于这些酶涉及中心代谢，以不影响细胞生 长的方式调节表达可能是必要的，例如，通过所述酶的重定位或分泌。
[0014] 在本发明的方法中，将微生物细胞（其可以是遗传修饰的或可以是野生型细胞） 生长到期望密度，接着裂解并将裂解物（其可以是粗制裂解物）与底物以及能量源（如果 在生产阶段需要的话）组合，并孵育达足以生成感兴趣的途径的期望产物的一段时间。另 外的底物，营养物，辅因子，缓冲物，还原剂，和/或ATP生成系统，可以添加到所述无细胞系 统。对所述微生物细胞的感兴趣的遗传修饰包括引入异源性酶来提供非天然酶促活性，并 还可以包括删除或下调不合需要的酶活性；以及增强或上调天然酶。在生产阶段期间，监控 至少一种并优选两种或更多的关键代谢参数，其中该监控可以是连续或间断的。基于关键 代谢参数的目标水平，其可以是预确定的目标水平，如上文所述调节代谢性能。
[0015] 在一些实施方案中，提供用于以高通量率生产感兴趣的产物的方法，所述方法包 括：生长细胞；裂解所述细胞；和在包含裂解物的无细胞系统中生产所述途径的产物，其中 监控并控制关键参数的代谢通量率。
[0016] 在一些实施方案中，用于监控和调整的代谢参数是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓 度，例如NAD，NADH，NADP和NADPH的一种或多种。在一些实施方案中，用于监控和调整的代 谢参数是ATP或ADP的浓度。在一些实施方案中，用于监控和调整的代谢参数是溶解的O 2 的浓度。
[0017] 在一些实施方案中，响应代谢参数监控调整选自葡萄糖-6磷酸脱氢酶，葡萄糖磷 酸异构酶和转氢酶的一种或多种酶的活性。
[0018] 在一些实施方案中，向所述无细胞系统添加增加电子泄露的化合物，例如，可以添 加质子载体（protonophore)，例如2, 4-二硝基苯酸（DNP);羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯 基腙（FCCP);和/或羰基氰化物m-氯苯腙（CCCP)。
[0019] 附图简述
[0020] 图1是中心代谢的特定方面的示意图。
[0021] 图2是用于从天冬氨酸盐生产高丝氨酸的样品代谢工程化网络图解，例如使用代 谢控制测试台（rig)。该生产途径由三个酶促步骤组成，每个产物分子需要两个NADPH分子 和一个ATP分子。该图解也表明了用于监控和控制的潜在参数。
[0022] 图3是代谢控制测试台的示意图。
[0023] 发明详述
[0024] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术 人员通常理解的相同意义。本文所引用的所有专利，专利申请（公开或未公开），以及其它 出版物通过提述以其整体并入本文。如果本节中列出的定义与通过提述并入本文的专利， 申请，公开的申请以及其它出版物中列出的定语相反或不一致，本节中列出的定义优先于 通过提述并入的定义。
[0025] 对出版物或文件的引用不旨在承认任何的这些出版物或文件是相关的现有技