比，骨关节炎滑膜组织细胞中CYP2F1基因表 达量显著增加，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0085] 2、CYP2F1基因表达一蛋白水平的检测
[0086] 2. 1步骤：使用常规的western blot进行CYP2F1蛋白水平的检测。
[0087] 2. 2统计学处理
[0088] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以0 -actin为内参，将CYP2F1 蛋白条带的灰度值进行归一化处理。实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平 均值土标准差的方式来表示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异 采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0089] 2. 3 结果
[0090] 结果如图2所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织细胞中CYP2F1蛋白的 表达量显著增加，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0091] 实施例20A成纤维样滑膜细胞增殖实验和抗体中和实验
[0092]1、0A成纤维样滑膜细胞增殖实验
[0093] 1. 1步骤
[0094]将FLS接种于96孔细胞培养板中，每孔2xl03cel 1 s/孔/200 y 1，37°C、5 % C02培养 箱孵育12小时后，加入滑膜液中（1 :5稀释），继续孵育24小时，加入3H-TdR(l y Ci/孔）， 再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁液，0计数仪检测cpm值。
[0095] 1. 2统计学方法
[0096] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0097] 1. 3结果
[0098] 结果如图3所示，与不加滑膜液刺激的对照组相比，加滑膜液刺激的0A成纤维样 滑膜细胞增殖明显加快，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0099] 2、成纤维样滑膜细胞抗体中和实验
[0100] 2. 1 步骤
[0101] 将0A成纤维样滑膜细胞接种至96孔培养板中，将抗人CYP2F1单抗按照1 :25的 比例加入滑膜液中混匀，同时设置无关单抗（1 :25)为对照，经过与滑膜细胞培养24小时后 加入3H-TdR(l y Ci/孔），再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁液，0计数仪检测cpm值。
[0102] 2. 2统计学方法
[0103] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0. 05 时具有统计学意义。
[0104]2. 3结果
[0105] 结果如图4所示，与不加人CYP2F1单抗的对照组相比，加人CYP2F1单抗的0A成 纤维样滑膜细胞增殖明显减慢，差异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0106] 实施例3干扰CYP2F1基因的表达
[0107]1、siRNA 设计合成
[0108] 针对 CYP2F1 的 siRNA 序列：
[0109] siRNAl-CYP2Fl：
[0110]正义链为 5' -UUGAUAAGGCGGAUAAUGGUG-3'（SEQ IDNO.7);
[0111]反义链为 5' -CCAUUAUCCGCCUUAUCAAUG-3'（SEQ IDNO.8)，
[0112] siRNA2-CYP2Fl：
[0113]正义链为 5' -UGGUAAAGUUGAAAAAGGCAG-3'（SEQ IDNO.9);
[0114]反义链为 5' -GCCUUUUUCAACUUUACCAAG-3'（SEQ ID NO.10)，
[0115] siRNA3-CYP2Fl：
[0116]正义链为 5' -AACUUUUGGGUACUUCAUGAG-3'（SEQ ID NO. 11);
[0117] 反义链为 5' -CAUGAAGUACCCAAAAGUUCA-3'（SEQ ID NO. 12)
[0118]阴性对照 siRNA 序列（siRNA-NC):
[0119]正义链为 5' -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（SEQ ID NO. 13);
[0120] 反义链为 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（SEQ ID NO. 14)。
[0121] 将OA成纤维样滑膜细胞细胞按IX 104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、 5% C02培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体 转染试剂2000 (购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分为、阴性对照组和实验组 (20nM)，其中，阴性对照组siRNA与CYP2F1基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分 别转染。
[0122] 2、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率方法同实施例1。
[0123] 3、统计学方法
[0124] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰CYP2F1基因表达组与对照组之间的差 异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0125] 4、结果
[0126]结果如图 5 显示，与 siRNA2-CYP2Fl、siRNA3-CYP2Fl 相比，siRNAl-CYP2Fl 能够更 有效的抑制CYP2F1基因的表达，差异具有统计学意义（P〈0. 05)，使用siRNAl-CYP2Fl进行 后续的实验。
[0127] 实施例4CYP2F1基因对骨关节炎滑膜组织细胞增殖的抑制作用
[0128] 1、细胞转染：按照实施例3的方法对0A成纤维样滑膜细胞进行siRNAl-CYP2Fl和 siRNA-NC的转染。
[0129] 2、转染24小时后加入3H-TdR(l y Ci/孔），再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁 液，0计数仪检测cpm值。
[0130] 3、统计学方法
[0131] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表 示，采用SPSS13. 0统计软件来进行统计分析的，干扰CYP2F1基因表达组与对照组之间的差 异采用t检验，认为当P〈0. 05时具有统计学意义。
[0132] 4、结果
[0133] 结果如图6显示，与siRNA-NC组相比，转染siRNAl-CYP2Fl的细胞增殖变慢了，差 异具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0134] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 人CYP2F1基因及其表达产物在制备诊断骨关节炎的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量 PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测CYP2F1基因及其表达产物的表达水平以诊断骨关节 炎的产品。3. 人CYP2F1基因在高通量测序平台中的应用，其特征在于，通过高通量测序能够获知 CYP2F1基因的表达异常与骨关节炎的发生和发展相关。4. 人CYP2F1基因及其表达产物在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。5. -种诊断骨关节炎的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测滑膜组织中CYP2F1 基因的表达来诊断骨关节炎。6. 根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核 苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测CYP2F1基因转录水平的针对CYP2F1基因的寡 核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的CYP2F1蛋白的特异性 抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括 用于检测CYP2F1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括CYP2F1蛋白的特异 性抗体。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对CYP2F1基因的引物 和/或探针。8. -种用于治疗骨关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含CYP2F1基 因和/或其表达产物的抑制剂。9. 根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述抑制剂是针对CYP2F1的 SiRNA010. 权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了CYP2F1基因可以作为骨关节炎早期诊断的分子标志物。本发明使用QPCR实验证明与正常滑膜组织相比，骨关节炎患者滑膜组织中的CYP2F1基因表达显著升高，且经过RNA干扰实验证明CYP2F1能够影响滑膜细胞的增殖。根据本发明的研究成果，可以研发能够抑制CYP2F1基因表达或者能够抑制CYP2F1基因表达产物功能的药物，从而实现临床上对于骨关节炎的预防和治疗。
【IPC分类】C12Q1/68, A61K31/713, G01N33/573, A61P29/00, A61P19/02, A61K48/00
【公开号】CN105039577
【申请号】CN201510548635
【发明人】杨承刚, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月31日