通管的四个管口分别与容器A的出液口、容器B的出液口、容器C的出液口和灌 流泵的进液口通过软管相连；灌流泵的出液口与热交换系统的进液口、热交换系统的出液 口与氧合器的进液口、氧合器的出液口与去泡器的进液口、去泡器的进液口与灌流导管的 进液口、回流泵的出液口与容器C的回流口均通过软管相连； 所述灌流导管的出液口伸入装肝脏容器中，所述装肝脏容器的底部还设有出液口； 所述三通管位于装肝脏容器的下方，三通管的其中两个管口分别通过软管连接装肝脏 容器的出液口、回流泵的进液口，三通管的第三个管口连接废液管，所述废液管上设有截止 阀。
2. 根据权利要求1所述的体外肝灌流装置，其特征在于： 所述容器A的进液口、容器B的进液口和容器C的进液口均为带液体灭菌滤膜的进液 漏斗，分别位于相应容器的顶部； 所述容器A的出液口、容器B的出液口和容器C的出液口均位于底部； 所述容器A、容器B和容器C的顶部均设有带空气滤膜的透气孔； 所述容器A、容器B和容器C均设有液位计。
3. 根据权利要求1所述的体外肝灌流装置，其特征在于：所述热交换系统由热交换器、 热循环泵和恒温水浴锅组成。
4. 根据权利要求1所述的体外肝灌流装置，其特征在于：所述容器A的容积为4-10L， 容器B的容积为1-2L，容器C的容积为2-4L。
5. 根据权利要求1所述的体外肝灌流装置，其特征在于：所述装肝脏容器带有帽盖。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的体外肝灌流装置，其特征在于：所述软管的内径为 6mm_IOmm〇
7. -种使用权利要求1-6任一项所述体外肝灌流装置进行原代肝细胞分离制备的方 法，其特征在于： (1) 将灌流液I装入容器A中，灌流液II装入容器B中，灌流液III装入容器C中； (2) 用灌流液I预灌注软管至去泡器出口，使容器A和去泡器出口之间充满灌流液I; (3) 取离体的动物肝脏置于装肝脏容器中，先用灌流液I灌流，灌流速度为 300-1000mL/min，灌流时间为10-12分钟；再用灌流液II灌流，灌流速度为300-1000mL/ min，灌流时间为2-3分钟；最后用灌流液III灌流，灌流速度为300-1200mL/min，灌流时间为 25-40分钟； 其中，所述灌流液I每升含有如下成分：8. 1-8. 5克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 2-2. 6克HEPES，3. 5-4. 5 克NAC, 0. 9-1. 1 克EGTA,其余为去离子水； 所述灌流液II每升含有如下成分：8. 1-8. 5克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 2-2. 6克HEPES，其余为去离子水； 所述灌流液III每升含有如下成分：3. 8-4克氯化钠，0. 5克氯化钾，23-25克HEPES， 0. 07克二水氯化钙，3. 5-4. 5克白蛋白，162-260WUnsch单位胶原酶，其余为去离子水； (4)分离肝细胞：洗涤步骤（3)处理后的肝脏，收集肝细胞悬液，过滤、离心，收集沉淀 即可。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（3)中， 所述灌流液I每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 4克HEPES，3. 5-4. 5 克NAC，0. 9-1. 1克EGTA，其余为去离子水； 灌流液II每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 4克HEPES，其余为去离 子水； 灌流液III每升含有如下成分：3. 9克氯化钠，0. 5克氯化钾，24克HEPES，0. 07克二水 氯化妈，4克白蛋白，162-260WUnsch单位胶原酶，其余为去离子水。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于： 所述灌流液I每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 4克HEPES，4克NAC，0. 95克EGTA，其余为去离子水； 灌流液II每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 4克HEPES，其余为去离 子水； 灌流液III每升含有如下成分：3. 9克氯化钠，0. 5克氯化钾，24克HEPES，0. 07克二水 氯化妈，4克白蛋白，216WUnsch单位胶原酶，其余为去离子水。
10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述灌流液III中，胶原酶为胶原酶 SERVA NB8 或者胶原酶Roche Liberase?。
11. 根据权利要求7-10任一项所述的方法，其特征在于： 所述灌流液I的灌流速度为400mL/min，灌流时间为10分钟； 灌流液II的灌流速度为400mL/min，灌流时间为2分钟； 灌流液III的灌流速度为500mL/min，灌流时间为30分钟。
12. 根据权利要求7-10任一项所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，灌流液I、灌流液 II、灌流液III的灌流温度均为37°C。
13. 根据权利要求7-10任一项所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，灌流液III的灌 流方式为循环灌流。
14. 根据权利要求7-10任一项所述的方法，其特征在于：步骤（3)中，灌流液I、灌流液 II和/或灌流液III的溶解氧分压为180-260mmHg。
15. 根据权利要求7-10任一项所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，所述过滤是用四 层脱脂纱布过滤。
16. 根据权利要求7-10任一项所述的方法，其特征在于：步骤（4)中，所述离心是多次 离心，具体步骤是： a、 离心，弃去上清液； b、 重悬沉淀，离心； c、 将过程b重复一次。
17.根据权利要求7或10所述的方法，其特征在于：离心的条件为：离心温度为4°C，离 心力为50-55 X g，离心的时间为10分钟。
18. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤b中，重悬沉淀采用肝细胞洗涤 液。
19.根据权利要求7-19任一项所述的方法，其特征在于：步骤b中，洗涤采用肝细胞洗 涤液洗涤。
20. 根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于：所述肝细胞洗涤液每升中含有如 下成分：9. 3-10. 8克Williams'Medium E粉末，2. 2克碳酸氢钠，2. 4-2. 8克HEPES，0.1克 链霉素，100000单位青霉素，其余为去离子水。
21. 根据权利要求20所述的方法，其特征在于：所述肝细胞洗涤液每升中含有如下成 分：9. 3-10. 8克Williams'Medium E粉末，2. 2克碳酸氢钠，2. 6克HEPES，0.1克链霉素， 100000单位青霉素，其余为去离子水。
22. 根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述肝细胞洗涤液每升中含有如下成 分：9. 5克Williams'Medium E粉末，2. 2克碳酸氢钠，2. 6克HEPES，0.1克链霉素，100000 单位青霉素，其余为去离子水。
【专利摘要】本发明公开了一种体外肝灌流装置，它包括由3个灌流液储存容器构成的灌流液储存容器组、四通管、灌流泵、热交换系统、氧合器、去泡器、灌流导管、三通管和回流泵。本发明的装置可以对离体肝脏进行三步肝灌流，最大限度地快速、连续进行前灌流液和消化液的有效灌注，最大程度地质控消化肝组织过程，节约成本，恒定温度，减少污染，从而保质保量的获得实验与临床所用的肝细胞，尤其是肝细胞移植、生物人工肝等所需的大量肝细胞。
【IPC分类】C12N5-071, C12M1-34, C12M1-02
【公开号】CN104845878
【申请号】CN201510284754
【发明人】包骥, 步宏, 石毓君
【申请人】四川大学华西医院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月28日