一种体外肝灌流装置及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明其涉及一种体外肝灌流装置及其用途。
【背景技术】
[0002] 原代猪肝细胞是BAL治疗中最合适的异种肝细胞源，现有成熟的肝细胞分离所采 用的方法是酶消化法，该方法是将胶原酶等注入肝脏血管，作用于肝组织，使肝细胞间复杂 的纤维连接溶解，从而获得完整的个体肝细胞。对于大动物，如猪，狗和人的肝脏等，由于体 积大，灌流液用量大，时间长，无论原位还是体外灌流都无法采用传统的人工注射器注入式 灌流，只能选用灌流泵。而使用灌流泵灌流时，由于缺乏专用的成套设备，致使灌流分离过 程中极易造成细菌等污染。由于胶原酶对温度要求很高，37°C为其最佳作用温度，没有专门 的灌流设备很难控制灌流液温度，因此，往往由于温度控制不好，而影响了最终的细胞消化 效果，不能达到所需细胞数量和质量要求，而且造成昂贵胶原酶的浪费，增加分离培养肝细 胞的成本。
[0003] 因此，目前需要一种适于消化分离大动物肝脏肝细胞的体外肝灌流装置。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种体外肝灌流装置，种体外肝灌流装置，其特征 在于：包括灌流液储存容器组、四通管、灌流泵、热交换系统、氧合器、去泡器、灌流导管、三 通管和回流泵；所述灌流液储存容器组包括容器A、容器B和容器C，所述容器A、容器B、容 器C均设有进液口和带有截止阀的出液口，所述容器C还设有回流口；所述灌流泵、热交换 器、氧合器、去泡器、灌流导管和回流泵均设有进液口和出液口；所述四通管的四个管口分 别与容器A的出液口、容器B的出液口、容器C的出液口和灌流泵的进液口通过软管相连； 灌流泵的出液口与热交换系统的进液口、热交换系统的出液口与氧合器的进液口、氧合器 的出液口与去泡器的进液口、去泡器的进液口与灌流导管的进液口、回流泵的出液口与容 器C的回流口均通过软管相连；所述灌流导管的出液口伸入装肝脏容器中，所述装肝脏容 器的底部还设有出液口；所述三通管位于装肝脏容器的下方，三通管的其中两个管口分别 通过软管连接装肝脏容器的出液口、回流泵的进液口，三通管的第三个管口连接废液管，所 述废液管上设有截止阀。
[0005] 进一步优选地，所述容器A的进液口、容器B的进液口和容器C的进液口均为带液 体灭菌滤膜的进液漏斗，分别位于相应容器的顶部；所述容器A的出液口、容器B的出液口 和容器C的出液口均位于底部；所述容器A、容器B和容器C的顶部均设有带空气滤膜的透 气孔；所述容器A、容器B和容器C均设有液位计。
[0006] 进一步优选地，所述热交换系统由热交换器、热循环泵和恒温水浴锅组成。
[0007] 进一步优选地，所述容器A的容积为4-10L，容器B的容积为1-2L，容器C的容积 为 2_4L。
[0008] 进一步优选地，所述装肝脏容器带有帽盖。
[0009] 进一步优选地，所述软管的内径为6mm-10mm。
[0010] 本发明利用热循环泵将水浴锅中37-42°C的热循环水以100-200mL/min的速度注 入热交换器中加热灌流液，使灌流液在整个灌流过程中保持37°C恒温。
[0011] 利用氧合器向灌流液中进行加氧处理，使灌流液中溶解氧分压保持在 180-260mmHg，降低了肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞内空泡，提高肝细胞的活力。
[0012] 利用去泡器在灌流液进入肝脏前去除灌流液中大小气泡，避免气泡在肝脏血管中 形成气体栓子，使肝脏灌流更加充分均匀。
[0013] 由于采用了上述技术方案，本发明的装置具有如下的优点：
[0014] 1.使用方便，运行可靠，灌流过程连续进行，单人只需在一小时内就可以完成操 作，节约人力、物力和时间。
[0015] 2.通过热交换器，灌流液在整个灌流过程中始终保持37°C恒温，满足了肝细胞分 离及胶原酶所需的恒定温定，保证了消化和分离肝细胞的活性。
[0016] 3.通过氧合器对灌流液进行了加氧处理，降低了肝细胞的缺氧时间，减少肝细胞 内空泡，提高肝细胞的活力。
[0017] 4.去泡器避免了肝脏血管中气体栓子的形成，保证了肝脏中所有细胞能获得均匀 的灌流。
[0018] 5.装置中采用大容量的灌流液储存容器，和高流速的灌流泵4匀速灌注，保证了 大动物肝脏灌流的压力和灌流液体积需求。
[0019] 6.整个灌注过程中，肝脏都处于有盖的装肝脏容器中，灌流液也处于无菌的管路 和容器中，避免了细菌、真菌的污染。
[0020] 综上所述，本发明提供了一种成套的，操作方便的用于消化分离大动物肝脏肝细 胞的体外肝灌流装置，它可以对离体肝脏进行三步肝灌流，最大限度地快速、连续进行前灌 流液和消化液的有效灌注，最大程度地质控消化肝组织过程，节约成本，恒定温度，减少污 染，从而保质保量的获得实验与临床所用的肝细胞，尤其是肝细胞移植、生物人工肝等所需 的大量肝细胞。
[0021] 本发明还提供了一种使用上述体外肝灌流装置进行原代肝细胞的分离制备的方 法：
[0022] (1)将灌流液I装入容器A中，灌流液II装入容器B中，灌流液III装入容器C中；
[0023] (2)用灌流液I预灌注软管至去泡器出口，使容器A和去泡器出口之间充满灌流 液I ;
[0024] (3)取离体的动物肝脏置于装肝脏容器中，先用灌流液I灌流，灌流速度为 300-1000mL/min，灌流时间为10-12分钟；再用灌流液II灌流，灌流速度为300-1000mL/ min，灌流时间为2-3分钟；最后用灌流液III灌流，灌流速度为300-1200mL/min，灌流时间为 25-40分钟；
[0025] 其中，所述灌流液I每升含有如下成分：8. 1-8. 5克氯化钠，0.5克氯化钾，2. 2-2. 6 克HEPES，3. 5-4. 5克NAC，0. 9-1. 1克EGTA，其余为去离子水；所述灌流液II每升含有如 下成分：8. 1-8. 5克氯化钠，0. 5克氯化钾，2. 2-2. 6克HEPES，其余为去离子水；所述灌流液 III每升含有如下成分：3. 8-4克氯化钠，0. 5克氯化钾，23-25克HEPES，0. 07克二水氯化 钙，3. 5-4. 5克白蛋白，162-260WUnsch单位胶原酶，其余为去离子水；
[0026] (4)分离肝细胞：洗涤步骤（3)处理后的肝脏，收集肝细胞悬液，过滤、离心，收集 沉淀即可。
[0027] HEPES :4_羟乙基哌嗪乙磺酸。
[0028] NAC:N_acetylcysteine,N-乙酰基-L-半胱氨酸。
[0029] EGTA:乙二醇二乙醚二胺四乙酸。
[0030] WUnsch单位：是胶原酶专用的活性单位。
[0031] 进一步地，步骤（3)中，所述灌流液I每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0. 5克氯 化钾，2. 4克HEPES，3. 5-4. 5克NAC，0. 9-1. 1克EGTA，其余为去离子水；
[0032] 灌流液II每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0.5克氯化钾，2. 4克HEPES，其余为 去离子水；
[0033] 灌流液III每升含有如下成分：3. 9克氯化钠，0. 5克氯化钾，24克HEPES，0. 07克 二水氯化钙，4克白蛋白，162-260WUnsch单位胶原酶，其余为去离子水。
[0034] 更进一步地，所述灌流液I每升含有如下成分：8. 3克氯化钠，0.5克氯化钾，2. 4 克HEPES，4克NAC，0. 95克EGTA，其余为去离子水；
[0035] 灌流液II每升含有如下成分：8. 3克氯