盒相一致。
[0034] 3.与传统的Northern印迹分析方法及试剂盒相比，本发明提供的基于无偏识别 与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，样品需求量很少，可以实现微量操作，尤其有利于检测物 中小RNA含量很少的情况；与实时定量PCR相比，本发明采用的恒温反应，无需使用昂贵的 热循环仪，体系设计更为简单，应用范围更广泛。
[0035] 4.本发明巧妙的利用小分子RNA作为三元杂交结构的参与链，稳定了三元杂交结 构的形成。由于小RNA不参与SDA聚合反应，其3'末端的修饰不会对依赖3'羟基的工具 酶的识别和作用产生影响，进一步确保了本发明应用的通用性和普适性。同时，本发明所设 计的级联放大方法无需茎环介导，避免了对茎环结构的设计与优化，简化了实验体系，在不 增加体系复杂性的条件下，实现了高效、快速的信号放大。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法流程示意图；
[0037] 图2-1为在聚合反应体系下切口酶能够循环酶切分子信标产生信号放大的可行 性验证结果图；
[0038] 图2-2为硫代修饰可以有效阻断切口酶对模板切割作用的熔解曲线分析图；
[0039] 图2-3为本发明所建立的级联放大方法与传统SDA方法的放大效果对比图，以荧 光强度表征；
[0040] 图2-4为本发明所建立的级联放大方法与传统SDA方法的放大效果对比图，以信 号/背景比值表征；
[0041] 图3-1为优化不同KF+聚合酶浓度对检测效果的影响结果；
[0042] 图3-2为优化不同Nt. BbvCI切口酶浓度对检测效果的影响结果；
[0043] 图4为根据荧光信号的检测结果与目标小RNA的浓度的标准曲线；
[0044] 图5为本发明与商品化的实时荧光定量PCR检测试剂盒的比对结果。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0046] 实施例1
[0047] 一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，包括：
[0048] 与目标小RNA形成三元杂交结构的组合物，包括10nM 3-WJ引物和10nM3-WJ模 板：
[0049] 3-WJ引物由两部分序列组成，5'端部分与目标小RNA 3'端部分互补，3'端部分与 3-WJ模板的中间段互补；
[0050] 3-WJ模板由三部分序列组成，3'端部分与目标小RNA 5'端部分互补，中间段与 3-WJ引物3'端部分互补，5'端部分为含两个核酸切口酶识别位点的SDA模板区域；其中一 个酶切位点经过硫代修饰；
[0051] 3-WJ引物的核苷酸序列为（5' to 3'）：
[0052] GTG CTC ACT CAT CCA AAA(SEQ. ID. NO. 1)
[0053] 含有酶切位点的硫代修饰3-WJ模板的核苷酸序列（5' to 3'），*表示硫代修饰：
[0054] TATTGTGTC*C*T*C*A*GC GCTGAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA(SEQ. ID. N0. 2)
[0055] 扩增底物，包括250uM dNTPs混合物；
[0056] 工具酶，包括具有链置换扩增活性的0. 5U DNA聚合酶和2. 5U核酸切口酶，用于触 发SDA产生带有内切酶位点的SDA产物；
[0057] 250nM带有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分 子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列；
[0058] 序列如下（SEQ. ID. N0. 3):
[0059] FAM-CCA CGA GTC AGT GTC CTC AGC GTG G-DABCYL
[0060] 以及扩增反应缓冲液（50mM KAc，lOmM Tris-HAc，lOmM Mg(Ac)2 及 ImM DIT)。
[0061] 即，该小RNA检测试剂盒中包括：10nM 3-WJ引物，lOnM 3-WJ模板，250uM dNTPs， 250nM分子信标探针，0? 5U DNA聚合酶（K1 enow Fragment exo^KD，2. 5U核酸切口酶（财. BbvCI),50mM KAc,10mM Tris-HAc,10mM Mg(Ac)2,ImM DTT〇
[0062] 本发明公开的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，具体流程参见图1 :
[0063] 将从植物或动物样本中提取的目标小RNA与三元杂交结构的组合物混合，小RNA 通过碱基互补配对与3-WJ模板，3-WJ引物形成并形成稳定的三元杂交结构；
[0064] 将三元杂交结构与扩增底物、工具酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合；在 三元杂交结构存在的情况下，DNA聚合酶识别3-WJ引物与3-WJ模板的SDA模板区域形成的 扩增起始位置，并进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的第一个核酸切口酶识别位 点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，由于靠近5'端的第二个酶切位点经硫代修饰， 阻断了第二次酶切，即可产生大量带有酶切位点的SDA产物，而三元杂交结构中的SDA模 板区域继续被扩增；
[0065] 扩增所获得的SDA产物触发打开分子信标的茎环结构，其荧光恢复；同时分子信 标与SDA产物形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位 点被识别，并在分子信标序列上进行切割；
[0066] 被切割的分子信标在反应温度下不稳定，从双链结构上脱落产生焚光信号，而SDA 产物可与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号；待达到规定的反应时间后， 检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中小RNA的含量，在一定范围内，小RNA浓度 越高，则荧光信号越强。
[0067] 1、本发明建立了基于硫代修饰3-WJ模板的级联放大策略，通过对模板进行硫代 修饰可以抵抗核酸切口酶的作用，实现SDA体系的级联放大。
[0068] 参见图2-1所示，以互补链作为对照验证了本方法的放大能力，通过酶切放大可 以显著提高荧光信号。再将这种放大的方法应用于基于硫代修饰3-WJ模板的级联放大策 略，通过对模板进行硫代修饰可以抵抗核酸切口酶的作用，实现SDA体系的级联放大。
[0069] 设计传统的3-WJ SDA模板（SDA组），无硫代修饰的3-WJ模板（对照组），硫代修 饰的3-WJ模板（本方法组）进行对照，验证了本发明级联放大的可行性。
[0070] 对照组：含有酶切位点的无硫代修饰3-WJ模板的核苷酸序列（5' to 3'）：
[0071] TAT TGT GTC CTC AGC GCT GAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA
[0072] 本方法组：含有酶切位点的硫代修饰3-WJ模板的核苷酸序列（5' to 3'），*表示 硫代修饰：
[0073] TAT TGT GTOOT*C*A*GC GCT GAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA
[0074] SDA组：不含酶切位点的常规3-WJ SDA模板的核苷酸序列（5' to 3'）：
[0075] AGT CAG TGT CCT CAG GCT GAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA。
[0076] 参见图2-2,为不同模板酶切反应后的溶解曲线分析结果。其中，a为硫代修饰 的3-WJ模板的无切口酶体系；b为硫代修饰的3-WJ模板的切口酶体系；c为无硫代修饰的 3-WJ模板的无切口酶体系；d为无硫代修饰的3-WJ模板的切口酶体系的溶解曲线分析，该 组图证明了硫代修饰可以有效的保护SDA模板，不会被内切酶作用，体系内有无内切酶计 划无差异，但是不被硫代修饰的3-WJ模板则在内切酶体系内被切断，溶解曲线表现出明显 的差异。
[0077] 参见图2-3和图2-4,为不同模板扩增体系SDA信号响应：对照组代表具有酶切位 点的无硫代修饰模板，由于体系内存在切口酶，模板被切断，荧光信号较低；SDA组代表无 酶切位点的常规SDA模板，表现出正常的荧光信号；发明提出的带有酶切位点的硫代修饰 模板，通过硫代修饰模板抵抗酶切，实现体系内的级联放大，具有显著的信号增强效果。
[0078] 2、本发明对Kr聚合酶以及Nt. BbvCI切口酶的浓度进行了优化，对比了体系内加 入不同浓度聚合酶（〇? 375u，0. 5u，0. 75u，lu)和 Nt. BbvCI 切