一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于小RNA检测技术领域，具体涉及一种基于无偏识别与恒温扩增的小 RNA检测试剂盒及定量方法。
【背景技术】
[0002] 小RNA是一类广泛存在于真核生物中的细胞内源性非蛋白编码RNA分子，其长度 约为20-30个碱基，主要包括小干扰RNAs (siRNAs)，微RNA (miRNA)和与piwi相互作用的 RNA(piRNA)。小RNA通过与特定的Argonaute家族蛋白（AGO蛋白）结合，指导AGO接近其 标靶分子（DNA或RNA)，通过RNA诱导的沉默复合物特异性的降低目标基因的表达。小RNA 参与调节细胞生长、发育、分化、增殖和凋亡等生命过程，影响着几乎所有的信号通路，参与 各种生理病理过程，发挥着重要的调节作用，其表达水平与人类疾病特别是肿瘤的发生和 发展密切相关，可以作为标志物用于一些癌症的早期诊断。因此，对定量检测组织、血液或 细胞样本中小RNA方法及试剂盒的深入研宄将有助于人们进一步了解小RNA与肿瘤发生、 发展的生物学机制，对肿瘤的早期诊断以及治疗具有重要的意义。
[0003] Northern blotting技术是小RNA检测的经典方法及试剂盒，一直被用于小RNA 的鉴定和发现等方面。该方法及试剂盒通过聚丙烯酰胺变性凝胶电泳对小RNA样品按大小 与分子量进行分离，然后将小RNA转移并固定至硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，再与标记好 的寡核苷酸探针杂交，洗膜后将非特异性结合的探针洗掉，最后经过显影获得信号。虽然该 技术被认为是小RNA检测的标准方法及试剂盒，但其灵敏度、特异性不高，操作步骤多且复 杂，耗时长（数天），对环境要求很高。
[0004] 相较于Northern blotting技术，微阵列芯片技术（Microarray)可以同时对多 种目标物进行分析，实现了小RNA的高通量检测。Microarray是利用分子杂交原理，通过 仪器把已知序列的DNA探针固定在玻璃片或者尼龙膜上形成阵列，然后加入多种待测的小 RNA与DNA探针进行杂交固定，通过检测杂交信号的强度，经数据处理后获得不同小RNA的 分析谱。然而，微阵列芯片技术制作成本高昂，灵敏度和重复性较差，选择性远不能让人满 O
[0005] 为了提高灵敏度和特异性，反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)已被应用于小RNA 的分析。然而，由于成熟小RNA分子长度较短，仅相当于PCR引物的长度，无法直接用PCR 技术实现扩增。另外，虽然RT-PCR具有较好的分析灵敏度和特异性，但是其依赖于热循环 扩增反应，需要大型反应仪器（PCR仪），同时要设计复杂的多种引物，极大地限制了它们的 广泛应用。
[0006] 为了简化反应条件和设计，同时又保持高灵敏度和选择性，研宄者们相继发展了 多种基于核酸恒温信号放大的小RNA检测方法及试剂盒。但是，近年来的研宄表明，多种小 RNA都存在3'末端甲基化，以使其免受细胞中多种核酸外切酶、连接酶、末端转移酶、聚合 酶等可作用于核酸3'末端羟基的酶攻击，从而保护小RNA的稳定。这些小RNA的3'末端 甲基化尽管没有改变核苷酸序列，却给现有的基于酶外切、酶聚合以及酶连接的检测技术 带来了极大的挑战，这些酶反应都需要与小分子RNA的3'末端发生作用，而3'末端的甲基 化会影响酶的识别能力，抑制酶反应的效率，最终导致检测结果不准确。因此，发展一种简 单、通用、快速、高灵敏、高选择性的小RNA检测方法及试剂盒依旧是一个挑战。
【发明内容】
[0007] 为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于无偏识别与 恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量方法，该试剂盒体系简单，使用方便，可实现高效、快 速的酶协同级联恒温扩增反应，灵敏度高。
[0008] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0009] 本发明公开了一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，包括：
[0010] 与目标小RNA形成三元杂交结构的组合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板；
[0011] 其中，3-WJ引物由两部分序列组成，其5'端部分与目标小RNA 3'端部分互补，3' 端部分与3-WJ模板的中间段互补；3-WJ模板由三部分序列组成：其3'端部分与目标小RNA 5'端部分互补，中间段与3-WJ引物3'端部分互补，其5'端部分为含两个核酸切口酶识别 位点的链置换扩增（SDA)模板区域，其中一个酶切位点经过硫代修饰；
[0012] 扩增底物，包括dNTPs混合物；
[0013] 工具酶，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶，用于三元杂交结 构形成所触发SDA反应的引物聚合延伸以及酶切级联放大，产生带有内切酶位点的SDA产 物；
[0014] 带有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信 标探针具有能够与SDA产物相互补的序列；
[0015] 以及扩增反应缓冲液。
[0016] 小 RNA 检测试剂盒中包括：10nM 3-WJ 引物，10nM 3-WJ 模板，250uM dNTPs，250nM 分子信标探针，0.5U DNA聚合酶（Klenow Fragment excT，KF〇,2. 5U核酸切口酶（财. BbvCI),50mM KAc,10mM Tris-HAc,10mM Mg(Ac)2,lmM DTT ；
[0017] 与SDA产物互补的分子信标探针序列中含有核酸切口酶Nt. BbvCI的酶切位点。
[0018] 3-WJ引物与3-WJ模板的摩尔比为1:1 ;且3-WJ引物与3-WJ模板有6个碱基的互 补。
[0019] 3-WJ引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；含有酶切位点的硫代修饰的3-WJ 模板的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 2所示；
[0020] 分子信标探针的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示；其两端分别标记有荧光基团 FAM和淬灭基团DABCYL。
[0021] 本发明公开了一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，包括以下步骤：
[0022] 1)提取获得待测目标小RNA ;
[0023] 2)通过核酸互补杂交，目标小RNA特异性识别3-WJ引物、3-WJ模板并形成稳定的 三元杂交结构；
[0024] 3)将三元杂交结构与扩增底物、工具酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合， 三元杂交结构中的三元引物沿着硫代修饰的三元模板起始链置换扩增反应并产生大量带 有酶切位点的单链SDA产物；
[0025] 4)扩增获得的SDA产物触发打开分子信标的莖环结构，恢复焚光；分子信标与SDA 产物形成的双链互补结构中含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别， 并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，SDA 产物与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号；
[0026] 5)待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析，得到待测溶液中小 RNA的含量。
[0027] 在3-WJ模板的SDA模板区域中含有两个Nt. BbvCI的识别位点，包括硫代修饰不 被切割的单链序列5' -CCTCAGC-3'和可被切口酶识别并切割的5' -GCTGAGG-3' ；
[0028] 靠近模板3'端的位点在SDA生成双链的过程中被Nt. BbvCI识别，在聚合产物位 点处切割实现SDA ;
[0029] 靠近模板5'端的位点被硫代修饰，阻断第二次Nt. BbvCI酶切，在产生大量带有酶 切位点的SDA产物的同时模板不被酶切。
[0030] 步骤3)所述的扩增反应中温度为37°C，反应时间为45分钟。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0032] 1.本发明提供的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，设计简单，一步 操作即可完成，无需增加体系复杂性即可实现高效、快速的酶协同级联恒温扩增反应，反应 快速，只需要30分钟，可以提高灵敏度到600fM ;
[0033] 2.本发明提供的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，具有很好的通用 性，巧妙的回避了核酸外切酶、连接酶、聚合酶等工具酶对核酸3'末端羟基的偏好性导致检 测结果不准确。可适用于各种修饰的小RNA序列，如3'末端2-0-甲基化修饰。并且只需 改变三元探针的序列而无需改变发卡探针及分子信标即可检测其他序列的小RNA，方便、价 廉。尤其是还能检测到植物样本中小RNA的表达水平，结果与商品化小RNA试剂