1.快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法,其特征在于,通过检测待测谷子材料中ACCase第5338位的单碱基进行鉴定,包括以下步骤:
A、dCAPS标记引物与酶切位点的确定:
以F2:GATGGGCTTGGTGTTGAAGAT为正向引物,以R2:TTCAGGGCAGAAAACCCAGTT为反向引物,使抗性基因在ACCase第5338位的位点产生一个酶切位点;
B、PCR扩增:以F2/R2为引物对,以待测谷子材料DNA为模板,进行PCR扩增,得到PCR扩增产物,PCR扩增产物长度为196bp;
C、酶切处理:用BglII酶切得到的PCR扩增产物,得到酶切产物片段;
D、抗拿捕净基因的鉴定:通过电泳查看酶切产物片段,若酶切后得到长度为196bp的单条带,则待测谷子材料为不抗拿捕净谷子材料;若酶切后得到长度为175bp的单条带,则待测谷子材料为纯合抗拿捕净谷子材料;若酶切后得到长度为196bp和175bp的两条带,则待测谷子材料为杂合抗拿捕净谷子材料。
2.根据权利要求1所述的快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法,其特征在于,步骤B中PCR扩增时,PCR反应体系包括:10×PCR Mix(Trans),12.5μl;10μmol引物F2,0.5μl;10μmol引物R2,0.5μl;模板DNA,1μl;ddH2O,10.5μl;总体积,25μl。
3.根据权利要求1所述的快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法,其特征在于,步骤B中PCR扩增时,PCR反应程序为:94℃预变性4min,94℃变性40s,60℃退火40s,72℃延伸15s,35个循环,72℃保温10min。
4.根据权利要求1所述的快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法,其特征在于,步骤C酶切处理中,酶切体系为:PCR扩增产物,7μl;10×Buffer,1μl;BglII,0.5μl;ddH2O,1.5μl;总体积,10μl。
5.根据权利要求1所述的快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法,其特征在于,在步骤A dCAPS标记引物与酶切位点的确定之前,还包括活性位点的确定,包括以下步骤:
a、扩增引物的确定:
F1:TGCTAGGATTGGCATAGCCG,
R1:CCACCAATGTTGGCAGGAAC;
b、PCR扩增:以F1/R1为引物对,以纯合型抗拿捕净谷子材料为DNA模板,进行PCR扩增,得到长度为558bp的纯合型PCR扩增产物;以F1/R1为引物对,以不抗型拿捕净谷子材料为DNA模板,进行PCR扩增,得到长度为558bp的不抗型PCR扩增产物;
c、活性位点的确定:将步骤b得到的纯合型PCR扩增产物和不抗型扩增产物进行测序,对测序结果进行序列比对,抗性材料在ACCase第5338位出现单碱基突变A-C,确定ACCase第5338位为活性位点。
6.根据权利要求5所述的快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法,其特征在于,步骤b中PCR扩增时,PCR反应体系包括:10×PCR Mix(Trans),12.5μl;10μmol引物F1,0.5μl;10μmol引物R1,0.5μl;模板DNA 1μl;ddH2O 10.5μl;总体积,25μl。
7.根据权利要求5所述的快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法,其特征在于,步骤b中PCR扩增时,PCR反应程序为:94℃预变性4min,94℃变性40s,58℃退火40s,72℃延伸15s,35个循环,72℃保温10min。