快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，涉及植物基因工程技术，具体涉及一种快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合或不抗的方法。

背景技术：

谷子抗旱、节水、耐瘠，营养丰富，是我国重要的粮食作物之一。传统谷子生产一直依赖人工间苗和除草，费工费时，抗除草剂谷子品种的的培育实现了谷子化学间苗和除草，使谷子集约化、规模化生产成为可能。拿捕净属于环己烯酮类除草剂，其作用靶蛋白是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，抑制脂肪酸的合成。河北省农林科学院谷子研究所通过谷子与野生抗拿捕净突变青狗尾草远缘杂交，培育出了系列抗拿捕净谷子新品种。

目前，抗拿捕净谷子是抗除草剂谷子育种的主要类型之一。通过选育抗、感拿捕净的同型姊妹系，二者按一定比例混合播种，利用二者对除草剂的抗性差异，苗期通过喷施除草剂即可同步实现谷子化学间苗、除草。然而，选育抗、感除草剂的同型姊妹系需要从低世代中选择杂合植株，达到所需农艺性状后，从高世代分离群体中选择抗、感同型姊妹系或在低世代开始保留抗、感植株，直到高世代形成重组自交系群体，从而选择农艺性状一致的抗、感姊妹系，因此无法通过喷施除草剂来达到选育目的。目前鉴定除草剂抗、感、杂合植株的主要方法有田间鉴定法和室内培养皿法。田间鉴定法即对穗行中的部分植株喷施除草剂，通过抗性差异，判断其抗、感、杂合情况。室内培养皿法是收获种子后，取部分用于室内培养皿发芽，通过喷施除草剂，观察其抗性差异，从而判断其抗、感、杂合情况。然而该两种方法工作量大，不适于大批量鉴定；同时，该方法易受环境因素的影响，影响判断结果。因此建立一种精准快速鉴定抗、感、杂合拿捕净谷子的方法，对提高谷子除草剂育种效率，缩短育种周期具有重要意义。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中的不足，提供了一种快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合或不抗的方法。

本发明为实现其目的采用的技术方案是：

快速精准鉴定谷子抗拿捕净基因纯合、杂合、不抗型的方法，通过检测待测谷子材料中ACCase第5338位的碱基进行鉴定，包括以下步骤：

A、dCAPS标记引物与酶切位点的确定：

以F2：GATGGGCTTGGTGTTGAAGAT为正向引物，以R2：TTCAGGGCAGAAAACCCAGTT为反向引物，反向引物使用基因组特异引物，正向引物中引入G-A、A-G的突变，使抗性基因在该ACCase第5338位的位点产生一个酶切位点；

B、PCR扩增：以F2/R2为引物对，以待测谷子材料DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR扩增产物长度为196bp；

C、酶切处理：用BglII酶切得到的PCR扩增产物，得到酶切产物片段；

D、抗拿捕净基因的鉴定：通过电泳查看酶切产物片段，若酶切后得到长度为196bp的单条带，则待测谷子材料为不抗拿捕净谷子材料；若酶切后得到长度为175bp的单条带，则待测谷子材料为纯合抗拿捕净谷子材料；若酶切后得到长度为196bp和175bp的两条带，则待测谷子材料为杂合抗拿捕净谷子材料。

步骤B中PCR扩增时，PCR反应体系包括：12.5μl 10×PCR Mix(Trans)、0.5μl 10μmol引物F2、0.5μl 10μmol引物R2、模板DNA 1μl和ddH₂O 10.5μl；总体积，25μl。

步骤B中PCR扩增时，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸15s，35个循环，72℃保温10min。

步骤C酶切处理中，酶切体系为：PCR扩增产物，7μl；10×Buffer，1μl；BglII，0.5μl；ddH₂O，1.5μl；总体积，10μl。。

在步骤A dCAPS标记引物与酶切位点的确定之前，还包括活性位点的确定，包括以下步骤：

a、扩增引物的确定：

F1：TGCTAGGATTGGCATAGCCG，

R1：CCACCAATGTTGGCAGGAAC；

b、PCR扩增：以纯合型抗拿捕净谷子材料为DNA模板，进行PCR扩增，得到长度为558bp的纯合型PCR扩增产物，以不抗型拿捕净谷子材料为DNA模板，进行PCR扩增，得到长度为558bp的不抗型PCR扩增产物；

c、活性位点的确定：将步骤b得到的纯合型PCR扩增产物和不抗型扩增产物进行测序，对测序结果进行序列比对，抗性材料在ACCase第5338位出现单碱基突变A-C，确定ACCase第5338位为活性位点。

步骤b中PCR扩增时，PCR反应体系包括：12.5μl 10×PCR Mix(Trans)、0.5μl 10μmol引物F1、0.5μl 10μmol引物R1、模板DNA 1μl和ddH₂O 10.5μl；总体积，25μl。

步骤b中PCR扩增时，PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸15s，35个循环，72℃保温10min。

本发明的有益效果是：本发明通过建立一种鉴定纯合、不抗、杂合型拿捕净谷子的方法，为提高抗拿捕净谷子种质的创制和育种效率奠定了基础。本发明根据抗拿捕净基因ACCase活性位点处单碱基的突变，建立了精准、简单快速鉴定抗、感、杂合拿捕净谷子的方法。与常规室内培养皿和田间植株鉴定法相比，该方法具有结果稳定可靠，操作简便、快捷、自动化程度高的优点。通过该分子标记辅助育种，可加快抗拿捕净谷子抗、感同型姊妹系配套品种的培育，缩短育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1是以F1/R1为引物对的PCR扩增产物图。

图2是不同谷子材料中ACCase抗拿捕净活性位点序列比较结果图。

图3是以F2/R2为引物对的PCR扩增产物图。附图中，1-12依次代表代表冀谷38、济谷20、沧368、保805、衡谷13、中谷5、冀谷19、豫谷1、中谷2、晋谷21、黄金苗、赤谷17。

图4是酶切鉴定图。附图中，1-12依次代表冀谷38、济谷20、沧368、保805、衡谷13、中谷5、冀谷19、豫谷1、中谷2、晋谷21、黄金苗、赤谷17。

图5是N-dCAPS在不同谷子品种中的检测结果图。附图中，1-18分别代表以冀谷38与黄金苗为亲本的F2植株。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。

一、抗拿捕净基因ACCase抗性位点验证

拿捕净抗性由显性单基因控制，其抗性是ACCase酶第1780位亮氨基酸取代异亮氨基酸引起的。为了验证其基因抗性突变位点，选取育成的抗拿捕净谷子品种冀谷38、济谷20、沧368、保805、衡谷13号、中谷5和敏感品系冀谷19、豫谷一号、中谷2、晋谷21号、黄金苗、赤谷17为材料进行分析验证。

根据抗拿捕净乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因序列(AF294805.1)，进行ORF预测和编码氨基酸预测。预测结果表明该ACCase全长6969bp，编码2321个氨基酸。通过与谷子基因组序列本地blast，获得拿捕净敏感型ACCase序列。抗、感序列比对结果表明，与敏感基因型相比，抗拿捕净基因在5338位存在单碱基突变，导致第1780编码子ATA突变为CTA，从而导致其编码异氨酸被亮氨酸取代。通过设计引物，PCR扩增包含编码1780位编码子的片段，测序验证在各品种是否一致。

分别以上述抗、感拿捕净品系为材料进行PCR扩增。引物为F1：TGCTAGGATTGGCATAGCCG，R1：CCACCAATGTTGGCAGGAAC。扩增片段长度558bp。反应体系为25μl，包括12.5μl 10×PCR Mix(Trans)、0.5μl 10μmol引物F1、0.5μl 10μmol引物R1、模板DNA 1μl和ddH₂O 10.5μl。反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增结果如图1所示，扩增片段大小与预期结果一致。扩增产物测序，对测序结果进行序列比对如图2所示，与拿捕净敏感型品种相比，抗性品种中出现单碱基突变A-C，进一步分析表明，该突变可造成该位点亮氨酸取代异亮氨酸，说明该处单碱基的突变是产生抗药性的原因。

二、快速鉴定谷子纯合、杂合、敏感拿捕净除草剂基因的分子标记

实施例1

针对该突变位点，开发可用于鉴定抗、感、杂合拿捕净的dCAPS标记通过设计dCAPS标记引物与酶切位点，反向引物使用基因组特异引物，正向引物中引入G-A、A-G的突变，使抗性基因在该位点产生一个BglII(A/GATCT)的酶切位点,而敏感型中没有。引物F2：GATGGGCTTGGTGTTGAAGAT为引入突变碱基引物，引物R2：TTCAGGGCAGAAAACCCAGTT为反向引物。引物扩增片段196bp。扩增PCR产物进行酶切，抗性基因含有酶切位点，BglII酶切后产175bp条带，敏感型基因无酶切位点，酶切后产生196bp大小条带。而对于杂合基因型酶切后产生175bp和196bp大小两条带。这三种类型可通过8％的非变性PAGE胶来区分。具体过程如下：

用F2/R2引物对，抗拿捕净谷子品种冀谷38、济谷20、沧368、保805、衡谷13、中谷5、和敏感品系冀谷19、豫谷1、中谷2、晋谷21、黄金苗、赤谷17DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为25μl，包括12.5μl 10×PCR Mix(Trans)、0.5μl 10μmol引物F2、0.5μl 10μmol引物R2、模板DNA 1μl和ddH2O 10.5μl。反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸15s，35个循环，最后72℃延伸10min。抗(序列1)、感(序列2)品种都扩增出196bp大小的条带，预期一致(如图3)扩增产物用BglII酶切，电泳。结果如图4，抗性品种出现175bp大小条带(序列1)，敏感型品种条带为196bp(序列2)与预期结果一致，说明该标记可用。命名为N-dCAPS。

实施例2、N-dCAPS在F2群体中的验证

为了进一步验证该标记的可行性，以抗性品种冀谷38与敏感型品种黄金苗的F2后代群体验证。F2植株在苗期已喷施除草剂。故检测植株应为纯合或杂合抗性植株。PCR扩增及酶切同上。共检测80株，部分检测结果如图3。在80株中出现175bp条带的有25株，出现175和196bp条带的有55株，未出现196条带的。根据标记原理175bp条带为纯合抗性植株，两条带为杂合抗性植株，196bp条带的为敏感型，因为苗期该群体已喷施除草剂，故未出现敏感类带型，检测结果与预期一致。另外两条带植株数与196bp条带植株数比值为2:1(P＝0.7820，χ²＝0.0765)，符合孟德尔遗传定律中F2植株纯合显现：杂合＝2:1的定律。进而说明该标记鉴定结果准确可靠。

综上所述，挖掘和利用可用于谷子育种的新型除草剂抗性基因，对于拓宽谷子抗除草剂育种、增加谷子除草剂抗性的多样性具有重要意义。抗拿捕净谷子种质的创制为培育新型除草剂谷子奠定了基础。本研究根据抗拿捕净基因ACCase活性位点处单碱基的突变，建立了精准、简单快速鉴定抗、感、杂合拿捕净谷子的方法。与常规室内培养皿和田间植株鉴定法相比，该方法具有结果稳定可靠，操作简便、快捷、自动化程度高的优点。通过该分子标记辅助育种，可加快抗拿捕净谷子抗、感同型姊妹系配套品种的培育，缩短育种周期，提高育种效率。