官型肝切片（η = 8)中的 存活，和表达对照发夹或靶向CKB的发夹的LvM3b细胞的器官型切片培养物（η = 8)。在第 〇天和第2天所取的图像显示CKB过表达足以显著增强癌细胞的能力。在这些测定法中，基 于单侧Student' s t检验发现P值低于0. 001或0. 0001。
[0197] 为了研宄CKB是否在miR-483-5p和miR-551a下游直接作用，将CKB的编码序列在 过表达miR-483-5p或miR-551a的细胞中过表达。简言之，实施测定法来检查注射有过表 达miR-483-5p和miR-551a的5X 105LvM3b细胞（有和无 CKB过表达）的小鼠中的转移性 进展。通过生物发光成像监测肝转移并在注射后35天将小鼠安乐死。发现CKB的过表达 足以拯救过表达miR-483-5p和miR-551a.的细胞的受抑制肝转移性表型。相反，CKB在展 现内源性miR-483-5p或miR-551a抑制的细胞中的敲低阻止了对miR-483-5p或miR-551a 抑制时看到的增强的转移效果。为此，实施测定法来检查注射有其内源性miR-483-5p和 miR-551a被LNA抑制的5X 105SW480细胞（有和无 CKB敲低）的小鼠中的肝转移。在28 天后将小鼠安乐死并切取肝用于离体生物发光成像。上述突变性的获得功能和失去功能实 验的结果和上位性分析揭示了 CKB是miR-483-5p和miR-551a的直接靶物且在结肠癌转移 性进展的调控中充当这些miRNA的下游效应物。在这些测定法中，基于单侧Student' s t 检验发现P值低于0. 05或0. 001。
[0198] 为了进一步确认CKB的作用，在小鼠肝中的对照SW480和过表达CKB的细胞中 检查相对体内胱天蛋白酶活性。通过生物发光来测量活性，其使用胱天蛋白酶-3活化的 DEVD-萤光素并标准化至来自常规萤光素的生物发光信号（η = 3)。还在表达对照发夹或 靶向CKB的发夹、且经由脾内注射引入小鼠肝中的SW480细胞中检查类似的相对体内胱天 蛋白酶-3活性。在注射后第1天、第4天和第7天测量胱天蛋白酶活性。与上述发现一致， 在肝定殖的起始阶段期间CKB过表达显著降低而CKB敲低显著增强体内胱天蛋白酶-3/7 活性。在这些测定法中，基于单侧Student's t检验发现P值低于0.05或0.001。这些发 现揭示了 CKB是肝转移性定殖期间结肠癌存活的促进物。
[0199] 实施例8
[0200] 已知CKB调控组织（如脑和肾）中快速移动的高能量磷酸盐的储库，其经由催化 高能量磷酸根基团从磷酸肌酸转移至ADP，从而产生ATP和肌酸。有假设认为，从磷酸肌酸 CKB生成ATP可能在肝定殖期间给结肠癌细胞提供了能量优势。为了确定CKB催化的终产 物ATP是否能拯救在CKB敲低时看到的转移抑制，在实验转移测定法中在注射之前将CKB 敲低细胞加载ATP。简言之，在注射有有和无 CKB敲低且用IOOuM ATP或媒介物预处理的 5X 105LvM3b的小鼠中检查肝转移。通过生物发光成像监测转移负担并在注射后21天将小 鼠安乐死。发现细胞的ATP加载足以将消耗CKB的细胞中受抑制的转移表型显著增强超过 10倍。通过ATP的拯救是特异性的，因为ATP加载并未增强表达短发夹对照的细胞的转移 性活性。
[0201] 进行了类似的研宄来确定肌酸和磷酸肌酸是否能拯救CKB敲低时看到的表型。 更具体地，实施测定法来检查在注射有在CKB敲低的背景下用IOuM肌酸预处理的5X 105LvM3b的小鼠中的肝转移。然后如上文描述的在注射后第21天将小鼠安乐死并提取肝用 于离体生物发光成像。还有，在注射有CKB敲低且用IOuM磷酸肌酸预处理的5X 105LvM3b 细胞的小鼠中检查结直肠癌转移。通过生物发光成像监测肝转移并入上文描述的将小鼠安 乐死。发现肌酸和磷酸肌酸均拯救转移抑制。
[0202] 为了研宄结肠癌转移是否能通过阻断肌酸运输到结肠癌细胞中来抑制，在LvM3b 细胞中通过表达靶向SLC6a8的短发夹来抑制肌酸运输通道SLC6a8。以与上文描述的相同 的方式来检查LvM3b细胞的肝转移。发现肌酸运输通道SLC6a8的敲低抑制结肠癌转移。这 些发现揭示结肠癌细胞在肝定殖期间依赖于CKB生成的ATP来存活。
[0203] 实施例9
[0204] 为了确定控制结肠癌转移性进展的这一协同性miRNA调控网络是否具有人病理 相关性，在自MSKCC的患者获得的一组67份原发性结肠癌以及肝转移中分析miR-483-5p 和miR-551a的表达水平。更具体地，通过定量实时PCR来对37份原发性肿瘤样品和30份 肝转移样品中的miR-483-5p和miR-551a水平定量。与这些miRNA在转移性进展期间的转 移抑制性作用一致，miR-483和miR-551a两者均展现出在人肝转移中相对于原发性结肠癌 的显著降低的表达水平（图Ia ;对于miR-483-5p为p〈0. 05而对于miR-551a为p〈0. 05 ;N =67) 〇
[0205] 还在37份原发性肿瘤样品和30份肝转移样品中通过定量实时PCR来检查CKB表 达水平。重要地，发现CKB表达在肝转移中相对于原发性结肠癌显著升高（ρ〈0. 05)且其表 达与所述miRNA显著逆相关一与这些miRNA在人结肠癌中对其直接靶向一致（图lb)。这 些发现与揭示CKB蛋白在晚期癌症中的升高水平的先前临床组织学分析一致。
[0206] 实施例10
[0207] 在本实施例中，实施测定法来研宄靶向该miRNA调控网络的治疗潜力。为此，用较 高数目（500k)的高度转移性LvM3a细胞注射小鼠并在24小时后用单静脉内剂量的、从单 一转录本表达miR-483-5p和miR-551a的腺病毒相关病毒（AAV)注射小鼠。发现投递两种 miRNA的单治疗剂量的腺伴随病毒（AAV)将转移性定殖急剧且显著降低超过5倍（图Ic)。
[0208] 最后，实施测定法来确定CKB的小分子抑制和肌酸可获性限制对于结肠癌转移的 影响。环肌酸（类似于磷酸肌酸）是针对肌酸激酶的转换态类似物。为了检查环肌酸的效 果，在注射有5X 105LvM3b细胞并用环肌酸每日治疗达两周的小鼠中实施对肝转移的生物 发光测量。然后，在治疗结束时将小鼠安乐死并切取肝用于离体成像。发现尽管环肌酸是 CKB的较差抑制剂（5000uM ki)，但用环肌酸治疗小鼠显著降低了转移性定殖且证明比目前 的标准医护FOLFOX化疗更好（图Id)。
[0209] 使用肌酸转运体抑制剂beta-胍基丙酸（B-GPA)来实施类似的测定法。利用生物 发光测量来检查注射有5X 105LvM3b细胞且用B-GPA每日治疗达两周的小鼠中的肝转移。 发现将小鼠用肌酸运输通道的这一竞争性抑制剂治疗也显著降低了转移性定殖（图Ie)。
[0210] 使用系统性办法，两种miRNA被鉴定为充当结肠癌细胞的肝转移性定殖的抑制 剂。发现这些miRNA会聚性靶向CKB-赋予遇到肝缺氧的细胞从磷酸肌酸储库生成ATP的 能力的一个关键基因。使用4种独立的治疗物（比目前的临床标准医护更有效，且展现出 没有明显的毒性）对该途径的成功靶向表明了靶向该途径的治疗在人结肠癌中的前景。上 文描述的组合的体内选择/基因筛选办法（称为经由器官内串联选择对人基因的多基因筛 选(MUlti-Gene Screening of Human genes through intra-Organ Tandem Selection) (MUGSHOTS))有效地鉴定了结肠癌的肝定殖和转移中的有力和经病理学验证的调控物，且 具有发现任意癌症类型在任意器官的转移性定殖中的编码和非编码调控物的潜力。
[0211] 实施例11
[0212] 在本实施例中，实施测定法来确认通过施用小分子B-GPA (其为SLC6a8的抑制剂） 靶向肌酸运输通道SLC6a8的治疗潜力。如上文描述的，对注射有LvM3b结肠癌细胞的小鼠 施用B-GPA在治疗两周后引起对结肠癌转移至肝的抑制（图Ie)。为了确认该治疗效果，将 注射有LvM3b结肠癌细胞的小鼠用B-GPA或对照媒介物（PBS)经由腹膜内注射每日处理达 3周（图2)。在3周时将小鼠安乐死并提取肝用于生物发光成像和大体组织学。
[0213] 发现用B-GPA每日治疗导致结肠癌转移至肝的显著降低，如通过体内小鼠的体内 生物发光成像、对提取的肝的生物发光成像、和通过对来自经治疗小鼠的提取肝的大体解 剖学检查评估的（图2)。更具体地，通过生物发光成像测量的对照组（没有B-GPA治疗） 和治疗组的平均光子通量比分别为约800和100。发现基于单侧Student's t检验的P值 为低于0.05。
[0214] 实施例12
[0215] 在本实施例中，实施测定法来估测用靶向SLC6a8的shRNA敲低来靶向肌酸运输通 道SLC6a8的治疗益处。
[0216] 简言之，用表达靶向肌酸运输通道SLC6a8的两种独立的短发夹RNA(shSLC6a8#4 或shSLC6a8#5)中任一的LvM3b结肠癌细胞或对照RNA (空pLKO载体，购自Sigma Aldrich) 来注射小鼠（图3a)。同样，通过生物发光成像来监测肝转移并在接种癌细胞后3周将小鼠 安乐死。提取肝用于大体组织学。发现将SLC6a8用两种独立的shRNA敲低导致对结肠癌 转移的抑制（图3a)。
[0217] 为了进一步确认敲低SLC6a8的治疗益处，将表达靶向SLC6a8(shSLC6a8#2)的短 发夹RNA的另一独立的结肠癌细胞系（SW480结肠癌细胞系）注射到小鼠中（图3b)。发现 SLC6a8敲低显著抑制SW480结肠癌细胞的转移（图3b)。
[0218] 最后，在胰腺癌细胞中研宄靶向SLC6a8的治疗益处。为了完成该目的，将表达靶 向SLC6a8 (shSLC6a8#5)的shRNA或对照RNA (空pLKO载体）的PANCl胰腺癌细胞注射到 小鼠中。通过生物发光成像监测转移性进展并以与上文所述相同的方式将小鼠安乐死。发 现在28天时，在用革El向SLC6a8的shRNA处理的细胞中在胰腺癌转移中有显著降低，从而揭 示了 SLC6a8是用于胰腺癌的治疗靶物。
[0219] 实施例13
[0220] 在本实施例中，研宄了肌酸转运体SLC6a8在人结肠癌肿瘤中的表达是否与转移 性进展相关。
[0221] 为了完成这一点，使用定量实时PCR来量化SLC6a8在36份原发性结肠癌肿瘤和 30份转移性结肠癌肿瘤中的表达（图4)。实际上，SLC6a8的表达在转移性肿瘤中（约I. 3) 比在原发性肿瘤中（约0.5)显著更高，进一步确证了 SLC6a8在转移中的枢纽作用（图4)。 发现基于单侧Student' s t检验的P值为低于0. 05。
[0222] 实施例14
[0223] 如上文描述的，显示用shRNA介导的敲低对肌酸转运体SLC6a8的抑制导致对两种 结肠癌以及胰腺癌的转移的抑制。还显示用小分子抑制剂B-GPA抑制SLC6a8在体内产生 对结肠癌转移的治疗益处。为了估测B-GPA治疗是否在胰腺癌治疗中产生治疗益处，在小 鼠中体内评估B-GPA治疗抑制人胰腺癌细胞存活的能力。
[0224] 简言之，将PANCl胰腺癌细胞在有和无 IOmM B-GPA存在的情况下温育48小时，然 后注射到免疫缺陷性小鼠中（每只小鼠5x105PANC1细胞；治疗分组和不治疗分组中各4只 小鼠）。在注射后1天将小鼠用生物发光成像并将信号标准至第0天。早在注射后1天就 观察到治疗益处，如通过生物发光成像（图4)评估的在体内胰腺癌细胞的肿瘤负担中有显 著降低，显示了 B-GPA治疗对于胰腺癌的治疗益处。更具体地，通过生物发光成像测量的对 照组（没有B-GPA治疗）和治疗组的平均光子通量比分别为约2. 7和1. 6。发现基于单侧 Student' s t检验的P值为低于0· 05。
[0225] 实施例15
[0226] 上述实施例展示单独的B-GPA治疗差生针对结肠癌和胰腺癌的治疗益处。在本实 施例中，研宄了 B-GPA治疗是否能增强化疗剂5' -氟尿嘧啶和吉西他滨的治疗活性。为了 实现该目的，实施细胞活力测定法来比较单独的5' -氟尿嘧啶或吉西他滨相比于与B-GPA 的组合疗法的细胞毒性活性。
[0227] 简言之，将10000PANC1细胞一式三份接种于96孔板中并用多个浓度的吉西他滨 (lnm, IOnm, IOOnm, 1000 nm, 1000 Onm, 1000 OOnm,和 1000 OOOnm)在有或无 IOmM B-GPA 的情况 下处理48小时。然后使用WST-I试剂（Roche Applied Science)测定细胞活力，将在440nm 处的吸光度作为活细胞数的指示物。如图6中显示的，发现添加治疗浓度的B-GPA增强了 吉西他滨对PANCl胰腺癌细胞的细胞毒性活性，如通过使用WST-I试剂的细胞活力测定法 评估的。
[0228] 类似地，添加治疗浓度的B-GPA增强了 5' -氟尿嘧啶对Ls_LvM3b结肠癌细胞的 细胞毒性活性。为此，将10, 〇〇〇Ls-LvM3b细胞一式三份接种于96孔板中并用多个浓度的 5'-氟尿嘧啶在有或无 IOmM B-GPA的情况下处理48小时。以与上述相同的方式测定细胞 活力，将在440nm处的吸光度作为活细胞数的指示物。如图7中显示的，这些结果显示B-GPA 增强了常见使用的化疗剂对于结直肠癌和胰腺癌治疗的治疗活性。
[0229] 前述实施例和对优选实施方案的描述应视为例示性的，而不是限制本发明由权利 要求限定的范围。如将容易领会的，可利用上述特征的众多变体和组合而不背离如由权利 要求所述的本发明。这类变化不视作背离本发明的范围，且所有这类变化均意图包括在所 附权利要求的范围中。本文中引用的所有参考内容均通过提述完整并入本文。
【主权项】
1. 一种用于在有此需要的受试者中治疗结肠癌的方法，包括降低所述受试者中肌酸激 酶脑型（CKB)或肌酸转运体通道SLC6a8(SLC6a8)的表达水平或活性。2. 权利要求1的方法，其中所述降低步骤通过对所述受试者施用环肌酸来实施。3. 权利要求2的方法，还包括对所述受试者施用另外的治疗剂。4. 权利要求3的方法，其中所述另外的治疗剂选自下组：beta_胍基丙酸 (beta-guanidinopropionicacid)、5_ 氟尿喃啶、奥沙利钼（Oxaliplatin)、伊立替 康（Irinotecan)、卡培他滨（Capecitabine)、吉西他滨（吉西他滨）、西妥昔单抗 (Cetuximab)、紫杉醇（Taxol)和阿伐斯汀（Avastin)。5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述癌症是转移性的。6. -种用于在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，包括对所述受试者施用beta-胍 基丙酸，其中所述癌症是选自下组的一种癌症：结肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺 癌、肺癌和黑素瘤。7. -种用于在有此需要的受试者中治疗结肠癌的方法，包括提高所述受试者中选自 miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平。8. 权利要求1的方法，其中所述结肠癌是转移性的。9. 权利要求7或8的方法，其中所述提高步骤通过对所述受试者施用编码miR-483-5p 或miR-551a的核酸来实施。10. 权利要求9的方法，其中所述核酸是寡核苷酸。11. 权利要求10的方法，其中所述寡核苷酸是合成的核酸。12. 权利要求9的方法，其中所述核酸在载体中。13. 权利要求12的方法，其中所述载体选自下组：质粒、病毒、粘粒和人工染色体。14. 权利要求13的方法，其中所述病毒是腺相关病毒（AAV)或POX病毒。15. 权利要求9-14中任一项的方法，其进一步包括对所述受试者施用另外的治疗剂。16. 权利要求9-14中任一项的方法，其中所述核酸包含SEQIDNO: 1-10中任一个或其 互补体的序列。17. -种用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌的方法，包括： 从所述受试者获得样品； 测量所述样品中选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平；和 将该表达水平与预确定的参照值比较； 由此如果该表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者患有或有风险患有 转移性结肠癌。18. -种用于确定受试者是否具有或有风险具有转移性结肠癌复发的方法，包括： 从所述受试者获得样品； 测量所述样品中选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平；和 将该表达水平与预确定的参照值比较，由此如果该表达水平低于所述预确定的参照 值，则确定所述受试者具有或有风险具有转移性结肠癌复发。19. 一种用于确定受试者是否具有或有风险具有对靶向疗法的化疗剂有抗性的转移性 结肠癌复发的方法，包括： 从所述受试者获得样品； 测量所述样品中选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的表达水平；和 将该表达水平与预确定的参照值比较， 由此如果该表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者具有或有风险具有 对靶向疗法的化疗剂有抗性的结肠癌或转移性结肠癌。20. 权利要求17-19中任一项的方法，其中所述预确定的参照值获自没有转移性结肠 癌的对照受试者。21. 权利要求17-19中任一项的方法，其中所述样品是体液样品。22. 权利要求17-19中任一项的方法，其中所述样品是肿瘤样品。23. -种阵列，其包含（i)具有多个独特位置的支持物，和（ii)具有与miR-483-5p、 miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物互补的序列的至少一种核酸的任意组合， 其中每个核酸被固定化于所述支持物的独特位置。24. -种用于诊断受试者中结肠癌的转移潜力的试剂盒，其包含特异性结合 miR-483-5p、miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物的试剂。
【专利摘要】本发明公开了用于诊断和治疗结肠癌的新药剂和方法。还公开了相关的阵列、试剂盒和筛选方法。
【IPC分类】A61P35/00, C12Q1/68, G01N33/53, A61P35/04
【公开号】CN104918659
【申请号】CN201380068468
【发明人】S.塔瓦佐薇, J.M.卢
【申请人】洛克菲勒大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年10月31日
【公告号】CA2890045A1, EP2914344A2, US9040497, US20140378534, US20150335601, WO2014071067A2, WO2014071067A3