结肠癌的治疗和诊断的利记博彩app
【专利说明】结肠癌的治疗和诊断
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求对2012年10月31日提交的美国临时申请No. 61/720, 912和2013年 3月15日提交的美国临时申请No. 61/786, 500的优先权。这些申请的内容通过提述完整并 入本文。
[0003] 政府利益
[0004] 本文中公开的发明至少部分在来自国家健康研宄所的拨款号I DP2 0D006506-01 下得到政府支持完成。因而，美国政府具有本发明的某些权利。 发明领域
[0005] 本发明涉及结肠癌的的诊断和治疗。
[0006] 发明背景
[0007] 结肠癌，常称为结直肠癌或肠癌，是来自结肠或直肠或阑尾中不受控的细胞 生长的癌症。参见例如，Cancer Genome Atlas Network,''Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer,''Nature 487:330 - 337 (2012 年 7月19日）。它是美国第二常见诊断的恶性和第二大常见的癌症死亡起因。例如，患有在 早期局部化阶段诊断出的结直肠癌的患者的五年存活率为92%，而如果容许癌症扩散至临 近器官或淋巴结则存活率降至64%，在有远端转移的患者中降至7%。
[0008] 结肠癌的预后与肿瘤经由肠壁的穿透程度和节参与的存在或缺乏直接相关。因 此，早期检测和治疗是重要的。目前，诊断由用于大便潜血的筛选测定、乙状结肠镜检查 (sigmoidoscopy)、结肠镜检查（colonoscopy)和双重对比钡灌肠剂的使用辅助。如由癌症 的类型和阶段决定的治疗方案包括手术、放射疗法和/或化疗。然而，手术（最常见的治疗 形式）之后的复发是一个主要问题且常是死亡的最终起因。尽管对该疾病的疗法进行了研 宄，但结肠癌仍是难以诊断和治疗的。如此，需要用于检测和治疗结肠癌的新药剂和方法。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明通过提供用于诊断和治疗结肠癌的药剂和方法着手解决上述需要。
[0011] 在一个方面，本发明特征在于一种用于在有此需要的受试者中治疗结肠癌（例如 转移性结肠癌）的方法。该方法包括增加所述受试者中选自miR-483-5p和miR-551a的 microRNA的表达水平。增加步骤可通过对所述受试者施用编码miR-483-5p或miR-551a的 核酸来实施。所述核酸可以是寡核苷酸，例如合成的核酸。核酸可以在载体，例如选自下组 的载体中：质粒、病毒、粘粒、人工染色体和其他源自细菌和/或病毒源的媒介物。病毒的例 子包括腺伴随病毒（AAV)或POX病毒。所述腺伴随病毒或POX病毒可被修饰以提高活性、 稳定性或特异性。在一些例子中，所述核酸含有SEQ ID NO: 1-10中任一个或其互补体的序 列。所述方法还可包括对所述受试者施用如本文中公开的另外的治疗剂。
[0012] 在第二个方面，本发明提供一种分离的RNA干扰（RNAi)药剂，其能抑制肌酸激酶 脑型（CKB)或肌酸转运体通道SLC6a8(SLC6a8)的表达。该药剂含有与编码CKB或SLC6a8 蛋白的基因的区域同源或互补的第一核苷酸序列。在一些例子中，所述第一核苷酸序列包 含SEQ ID NO: 11-18中任一个的序列。
[0013] 本发明还提供一种分离的核酸，其包含编码上述RNAi药剂的序列的分离的核酸 和拥有该核酸的载体。所述载体可以是选自下组的载体：质粒、病毒、粘粒、人工染色体和其 他源自细菌和/或病毒源的媒介物。优选地，载体是病毒载体，例如AAV病毒载体。还提供 具有上述RNAi药剂、核酸或载体的宿主细胞。另外提供一种药物组合物，其具有（a)药学 可接受的载体，和（b)所述RNAi药剂、核酸或载体。所述RNAi药剂、核酸或载体可以与其 他药剂例如脂质体化合物或聚乙烯胺复合用于有效投递。在一个实施方案中，所述药物组 合物还含有另外的治疗剂。
[0014] 在第三方面，本发明特征在于一种用于在有此需要的受试者中治疗癌症如结肠 癌（例如转移性结肠癌）或胰腺癌的方法。该方法包括降低所述受试者中CKB或SLC6a8) 的表达水平或活性。所述降低步骤可通过对所述受试者施用核酸、小分子化合物或两者 来实施。在一个例子中，所述降低步骤通过对所述受试者施用环肌酸或beta-胍基丙酸 (guanidinopropionic acid)来实施。在其他例子中，降低步骤通过对所述受试者施用选自 下组的药剂来实施：上文描述的RNAi药剂、核酸和载体。在一些实施方案中，所述方法还包 括对所述受试者施用另外的治疗剂，如beta-胍基丙酸。
[0015] 本发明特征还在于一种用于在有此需要的受试者中治疗癌症如结肠癌或胰腺癌 的方法。该方法包括通过抑制肌酸转运体通道SLC6a8来降低所述受试者中肌酸的水平。 该方法包括对所述受试者施用beta-胍基丙酸以及任选地另外的治疗剂。另外的治疗剂 的例子包括选自下组的一种或多种：上文所述的环肌酸、RNAi药剂、核酸和载体。另外的 治疗剂的其他例子包括5-氟尿喃啶、奥沙利钼（Oxaliplatin)、伊立替康（Irinotecan)、 卡培他滨（Capecitabine)、吉西他滨（Gemcitabine)、西妥昔单抗（Cetuximab)、紫杉醇 (Taxol)、阿伐斯汀（Avastin)、亚叶酸（Ieucovorin)、Regorafenib、Zaltrap、拓扑异构酶 I 抑制剂、NKTR-102、Tivantinib、PX-866、索拉非尼（Sorafenib)、Linifanib、激酶抑制剂、 Telatinib、XL281 (BMS-908662)、Robatumumab 和 IGFl-R 抑制剂。
[0016] 在第四方面，本发明提供一种用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠 癌的方法。该方法包括：（i)从所述受试者获得样品；（ii)测量所述样品中选自miR-483-5p 和miR-551a的microRNA的表达水平；和（ii)将该表达水平与预确定的参照值比较。如 果该表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者患有或有风险患有转移性结肠 癌。所述预确定的参照值可以获自不患有转移性结肠癌的对照受试者。样品可以是体液样 品或活组织检查肿瘤样品。该方法还可用于确定受试者是否有或有风险具有转移性结肠癌 复发，或用于确定受试者是否患有或有风险患有对化疗剂或靶向疗法有抗性的结肠癌或转 移性结肠癌。更具体地，如果所述表达水平低于所述预确定的参照值，则确定所述受试者 有或有风险具有转移性结肠癌复发、或对化疗剂或靶向疗法有抗性的结肠癌或转移性结肠 癌。
[0017] 在第五方面，本发明提供一种阵列，其具有（i)具有多个独特位置的支持物，和 (ii)具有与miR-483-5p，miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物（例如mRNA或 相关cDNA)互补的序列的至少一种核酸的任意组合。例如，核酸可以与SEQ ID NO: 1-18之 一互补或在严格杂交条件下，与SEQ ID NO: 1-18之一杂交。每个核酸被固定化于所述支持 物的独特位置。
[0018] 本发明还提供一种用于诊断受试者中结肠癌的转移潜力、转移性结肠癌复发的潜 力、转移性结肠癌快速进展的潜力或转移性结肠癌展现对化疗的抗性的潜力的试剂盒。该 试剂盒包含特异性结合miR-483-5p，miR-551a或编码CKB或SLC6a8的基因的表达产物（例 如mRNA，cDNA和多肽）的试剂。所述试剂可以是具有与miR-483-5p和miR-551a序列互补 的序列的探针。例如，每个探针可具有与SEQ ID NO: 1-18之一互补或在严格杂交条件下， 与SEQ ID NO: 1-18之一杂交的序列。试剂盒还可包含用于实施杂交测定法或PCR测定法 的试剂或上文所述的阵列。
[0019] 在第六方面，本发明提供一种鉴定可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺 氧存活、转移存活或转移性定殖（metastatic colonization)的化合物的方法。所述方法 包括（i)获得表达选自miR-483-5p和miR-551a的microRNA的测试细胞；（ii)将该测试 细胞暴露于测试化合物；（iii)测量测试细胞中所述microRNA的表达水平；（iv)比较该表 达水平与对照水平；和（V)如果该比较指示表达水平高于对照水平，则选择该测试化合物 作为可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺氧存活、转移存活或转移定殖的候选物。
[0020] 本发明还提供一种鉴定可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、缺氧存活、转 移存活或转移定殖的化合物的方法。所述方法包括（i)获得能够表达选自CKB或SLC6a8的 基因的多肽或mRNA的测试细胞；（ii)将该测试细胞暴露于测试化合物；（iii)测量测试细 胞中所述基因的表达水平；（iv)比较该表达水平与对照水平；和（V)如果该比较指示表达 水平低于对照水平，则选择该测试化合物作为可用于治疗结肠癌或用于抑制癌细胞存活、 缺氧存活、转移存活或转移定殖的候选物。
[0021] 在上述方法中，对照水平可获自与测试细胞相同的对照细胞，只不过对照细胞尚 未暴露于测试化合物。测试细胞可以是结肠癌细胞系（例如LS-174T人结肠癌系）的细 胞。在一些实施方案中，基因的表达水平可使用报道物构建体测量，其中报道基因（例如编 码萤光素酶、GFP或LacZ的基因）可操作地连接于编码上述miR-483-5p，miR-551a，CKB，或 SLC6a8的基因的启动子。
[0022] 本发明还提供一种用于在有此需要的受试者中治疗乳腺癌、胃癌、胰腺癌、食道 癌、肝癌、胆囊癌、前列腺癌、肉瘤癌、黑素瘤或肺癌的方法。该方法包括对所述受试者施用 beta-胍基丙酸等。
[0023] 下文中陈述了本发明的一个或多个实施方案的详情。本发明的其他特征、目的和 优点从说明书和权利要求将是显而易见的。
[0024] 附图简述
[0025] 图IA-E是一组图和照片，其显示miR-483-5p、miR-551a和CKB是临床相关的并且 可以被治疗性抑制。a，通过定量实时PCR对37份原发性肿瘤样品和30份肝转移样品中的 miR-483-5p和miR-551a水平定量。b，通过定量实时PCR对37份原发性肿瘤样品和30份肝 转移样品中的CKB表达水平定量。c，注射有LvM3b细胞并在注射细胞后一天用单剂量的双 重表达miR-483-5p和miR-551a的AAV治疗的小鼠中的肝转移。d，注射有5X 105LvM3b细胞 并每日用环肌酸治疗达两周的小鼠中肝转移的生物发光测量。在治疗结束时将小鼠安乐死 并切取肝用于离体成像。e，注射有5X 105LvM3b细胞并每日用肌酸转运体抑制剂beta-胍 基丙酸（B-GPA)治疗达两周的小鼠中肝转移的生物发光测量。误差条，s.e.m;所有P值基 于单侧 Student' s t 检验。*Ρ〈0· 05 ;林Ρ〈0· 001 ;林*Ρ〈0· 0001。
[0026] 图2是显示B-GPA治疗抑制结直肠癌转移的一组图和照片。注射有5X10sLvM3b细 胞并每日用B-GPA治疗达三周的小鼠中肝转移的生物发光测量。在三周时将小鼠安乐死并 切取肝用于生物发光成像和大体组织学（gross histology)。误差条代表s.e.m;所有P值 基于单侧 Student' s t 检验。*Ρ〈0· 05〇
[0027] 图3A-C是一组图和照片，其显示肌酸转运体物SLC6a8是结直肠癌和胰腺癌转移 需要的。a)表达靶向肌酸转运体通道SLC6a8的短发夹的高度侵入性LvM3b细胞的肝转移。 通过生物发光成像监测肝转移并在接种癌细胞后三周将小鼠安乐死。提取肝用于大体组织 学。b)在注射有用靶向SLC6a8的shRNA转导的5X 105SW480细胞的小鼠中的肝转移。通 过生物发光成像监测转移进展。在注射后28天将小鼠安乐死并切取肝用于生物发光成像 和大体组织学。c)在注射有用靶向SLC6a8的shRNA转导的5X IO5PANCl胰腺癌细胞的小 鼠中的肝转移。通过生物发光成像监测转移进展并将小鼠安乐死，如上文描述的。误差条 代表 s. e. m ;所有 P 值基于单侧 Student' s t 检验。*Ρ〈0· 05 ;#Ρ〈(λ 001 ;*#Ρ〈(λ 0001。
[0028] 图4是显示与原发性肿瘤相比SLC6a8在肝转移中上调的图。通过定量实时PCR 对36份原发性肿瘤和30份肝转移中SLC6a8的表达定量。误差条代表s. e. m ;所有P值基 于单侧 Student' s t 检验。*Ρ〈0·05〇
[0029] 图5是显示B-GPA治疗在体内抑制肝中弥散性（disseminated) PANCl胰腺癌细胞 存活的一组图和照片。在有和无 IOmM B-GPA预处理达48hr的情况下注射有5x105PANC1细 胞的免疫缺陷性小鼠的生物发光成像。在注射后第1天对小鼠成像并相对于第〇天将信号 标准化。P值基于单侧Student' s t检验。*Ρ〈0· 05。
[0030] 图6是显示B-GPA增强吉西他滨对PANCl胰腺癌细胞的细胞毒性的图。在用逐步 升高剂量的仅吉西他滨或逐步升高剂量的吉西他滨与IOmM B-GPA组合治疗后PANCl胰腺 癌细胞的细胞存活力。使用WST-I试剂测定细胞存活力。误差条代表均值的标准误差。
[0031] 图7是显示B-GPA增强5'-氟尿嘧啶对LS-LvM3b结直肠癌细胞的细胞毒性的图。 在用逐步升高剂量的仅5' -氟尿嘧啶或逐步升高剂量的5' -氟尿嘧啶与IOmM B-GPA组合 治疗后Ls-LvM3b细胞的细胞存活力。使用WST-I试剂测定细胞存活力。误差条代表均值 的标准误差。
[0032] 发明详述
[0033] 本发明至少部分基于以下预料不到的发现，即协同性miRNA-蛋白质网络在转移 性结肠癌的肝定殖中失调，且miRNA(例如miR-483_5p和miR_551a)通过协同性革El向脑肌 酸激酶依赖性能量学来抑制结肠癌转移性存活。因此，本发明提供用于诊断和治疗结肠癌， 特别是转移性结肠癌的新药剂和方法。
[0034] 弥散性癌细胞对器官的定殖代表癌症进展的最终、临床上最重大的和了解最少的 阶段。肝是许多癌症类型的这类转移性定殖的高度常见器官。为了了解肝定殖的分子基础， 建立了结肠癌的肝定殖的体内选择模型。由于它将竞争性器官内体内选择与小RNA序型分 析（profiling)偶联以平行地功能性评估611种microRNA在肝定殖期间的体内作用，因此 它是一种强大的系统。如本文中公开的，内源性miR-483-5p和miR-551a被鉴定为许多突 变背景的多种结肠癌群体中肝转移性定殖的有力抑制剂。这些miRNA在转移性细胞中和人 肝转移中是表观遗传沉默的，而且通过靶向脑型肌酸激酶（CKB)来抑制转移。
[0035] 如本文中公开的，CKB通过增强弥散性癌细胞在肝（在该处其遇到肝缺氧）中的 存活来促进转移。结肠癌存活依赖于磷酸肌酸的CKB产生，磷酸肌酸充当用于生成忍耐肝 缺氧所需的ATP的能量库。与此一致，经由肌酸转运体敲低来抑制癌细胞肌酸摄取也减少 转移。经由腺伴随病毒投递治疗性施用miR-483-5p和miR-551急剧抑制结肠癌转移。另 外，用小分子抑制剂治疗性靶向CKB显著抑制结肠癌转移。这些结果突显了代谢能量学在 癌症进展期间在维持转移性存活中的重要性。本文中公开的发现对于治疗优先定殖到肝且 每年索取超过500, OOO人的生命的胃肠恶性具有重要的启示。而且，本文中公开的体内筛 选/选择办法有全面和快速鉴定调控任何癌症类型对任何器官的定殖的编码和非编码基 因的潜力。
[0036] 如本文中公开的，经由上文所述的办法，一组miRNA被鉴定为在人转移结肠癌系 中失调（deregulated)。如本文中公开的，miR-483_5p和miR-551a充当结肠癌转移的有力 内源抑制剂，其经由会聚性靶向代谢基因肌酸激酶脑型（CKB)实现。这些miRNA在鉴定形 成结肠癌转移性复发的患者中展现出重要的预后能力，而治疗性投递这些miRNA则显著抑 制结肠癌转移。
[0037] 本文中公开的miRNA-蛋白质网络的成员可用作用于治疗转移性结肠癌的靶物。 另外，该成员可用作生物标志物，用于确定受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌，或 用于确定患有该病症的患者的预后或监测。因此，本发明涵盖通过靶向一个或多个所述成 员治疗转移性结肠癌的方法，确定用于抑制癌症的治疗方案的功效的方法，和鉴定抗癌剂 的方法。还提供诊断受试者是否患有或有风险患有转移性结肠癌的方法，和筛选出认为有 风险形成该病症的受试者的方法。本发明还涵盖适用于实施上述方法的各种试剂盒。
[0038] 治疗方法
[0039] 如本文中公开的，miR-483-5p和miR-551a被鉴定为结肠癌和其他癌症类型中的 癌细胞存活、缺氧存活、转移性存活、或转移性定殖的内源性转移抑制剂，而CKB和肌酸运 输通道SLC6a8发挥同一过程的转移促进物作用。这些miRNA或蛋白质不仅强烈预测人转 移结果，而且还提供用于治疗癌症如结肠癌和其他癌症类型的靶物。
[0040] 因此，本发明提供在治疗癌症如结肠癌和其他癌症类型中使用相关药剂（包括 microRNA、靶向CKB的RNAi药剂、靶向SLC6a8的RNAi药剂、编码这类RNAi药剂的载体（例 如AAV)、环肌酸和胍基丙酸）的方法，其经由增加所述受试者中一种或多种转移抑制剂的 表达水平或活性水平进行。该增加可通过迫使一种或多种转移抑制剂表达等来实现。另 外，治疗可通过降低一种或多种转移促进物的表达水平或活性水平来实现。其他癌症类型 的例子包括实体肿瘤，特别是癌。例示性实体肿瘤包括但不限于，肺癌、乳腺癌、骨癌、卵巢 癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、精巢癌、肝癌、腮腺癌、胆管癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、子 宫癌、子宫内膜癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、间皮瘤 黑素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、卡波西肉瘤、和肉瘤。具 体地，本发明的方法可用于治疗胃癌、食道癌、胰腺癌、肝癌、胆管癌和乳腺癌。
[0041] 转移抑制剂的强迫表达
[0042] miR-483-5p和miR-551a两者和编码它们的核酸均可用作转移抑制剂，从而通过 在目的细胞或有此需要的受试者中将其过表达来实施本发明。
[0043] "过表达"指由导入宿主细胞的核酸所编码的RNA或多肽的表达，其中该RNA或多 肽或蛋白质或者正常不存在于该宿主细胞中，或者其中该RN