一种巨芒化学消毒组培方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种巨芒化学消毒组培方法，属生 物技术领域。
【背景技术】
[0002] 巨芒（Miscanthus giganteus)亦称奇岗，是禾本科芒属多年生C4禾草，植株高度 可达4m所以称其为巨芒。原产于日本，40年代引进丹麦，后被欧洲多个国家、美国引进作为 能源植物研宄种植。近年来国内许多单位包括中国农大、中科院等先后引进作为能源植物 进行研宄。巨芒之所以在欧洲、美国被认为是最具潜力的能源作物，被赋予解决未来能能源 与环境问题的希望之星，其主要特点为：1、为C4植物，具有高光效、低呼吸、C02补偿点等高 产作物的理想特性；2、多年生草本，一年种植，可以连续收获12-20年；3、产量高，干物质产 量达12-20吨/亩。在欧洲、美国及国内等试验中都显著高于其他作物；4、枝叶成熟后，体 内主要的营养成分将回流至根部，可以节约肥料，能源投入产出比效率是小麦、玉米等主 要作物的3-5倍；5、易燃烧且乙醇转化率高达50%。芒草不仅具有很高的生物质产量，而且 其收获时水分含量仅有20% - 30%，低水分含量有利于燃烧。此外，它的挥发性物质是煤 的3倍，它具有比煤炭更好的点火稳定性；6、抗逆性强，耐旱、耐寒能力显著强于主要作物。 且病虫害发生少。，近年来，欧洲各国已广泛种植巨芒，主要是利用其燃烧发电。目前芒草发 电量占欧盟15国总产电量的9%，其中爱尔兰芒草产电量占全国产电总量的37%，为欧盟 各国最高。美国也在Illinois州和Michigan州大田种植。由于巨芒对自然条件要求不高， 能在边际土地上生长并获得较高产量，利用其进行能源生产不仅不会占耕地还充分利用了 边际土地，在我国应用前景巨大。目前国内已有浙江、福建、广西、山东等地已有少量种植。
[0003] 由于巨芒属于三倍体，无可育的种子。生产上只能利用其地下根茎作为种子。但以 其地下根茎作为种苗，其繁殖系数极低，同时，种茎体积大，运输不仅不方便，且易损伤。这 成为规模化种植的最大障碍。目前，最好的解决办法就是利用组织培养技术大量生产种苗， 但组织培养生产种苗的关键又在于降低成本。组织培养的各个环节均需配置相应的设施设 备及常规耗材，成本较高，能源消耗较大，同时整个流程要在无菌条件下操作，人工操作成 本高。如果能通过培养基改造，获得既保证组培苗的正常生长，又具有杀菌、抗菌或抑菌功 能的培养基，这样可以大幅度节约组培苗等生产成本，是解决巨芒种苗的生产应用成本高 的难题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种巨芒化学消毒组培方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0006] 本发明的一种巨芒化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、愈伤组织 诱导培养、分化培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
[0007] 1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠 +10mg/L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸妈的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
[0008] 2.培养基配制：愈伤组织诱导培养基为MS+2~5mg/L 2,4-D+0.5~2g/L AC+50~100mg/L次氯酸钠+50~100mg/L特美汀+0. 1~0. 5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L 蔗糖+3. 5g/L琼脂粉，pH5. 8 ;分化培养基为：MS+3~8mg/L 6-BA+0. 1~0? 5mg/L NAA+50~ 100mg/L次氯酸钠+50~100mg/L特美汀+0? 1~0? 5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L鹿糖 +3. 5g/L琼脂粉，pH5. 8 ;生根培养基为1/2MS+0. 1~0? 5mg/L NAA+50~100mg/L次氯酸 钠+50~100mg/L特美汀+0. 1~0. 5mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3. 5g/L琼脂粉， pH5. 8 ;所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄 氨基嘌吟；所述NAA，指^-萘乙酸；所述AC，指活性炭；配制培养基时，先称各培养基配方 中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配 方配齐其他原料后，定容，然后用lmol/L的NaOH或lmol/L的HCl调pH值至5. 8,分装到消 毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
[0009] 3.愈伤组织诱导培养：于巨芒的旗叶期，截取幼穗的长度为10-20cm，去除外层苞 叶，仅留一片内叶；先用体积比为70%的酒精表面消毒lmin，蒸馏水清洗3次，再用镊子剥 去内叶，体积比为2%的次氯酸钠消毒IOmin，无菌水冲洗3-4次。在超净工作台上将幼穗切 成2mm的小段，放在愈伤组织诱导培养基上培养，每周转接一次；培养室温度为25~28°C， 暗培养；4周后转到光照培养，光照强度为1500~20001x ;
[0010] 4.分化培养：挑取诱导培养获得的部分黄绿色愈伤组织，接种到分化培养基中， 培养4周成为不具根的小苗，每30d转接一次；培养室温度为26°C，光照12h，光照强度为 2000 ~30001x ;
[0011] 5.生根培养：将分化培养的不具根小苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完 整植株；培养室温度为25°C，光照16h，光照强度为2000~30001x ;
[0012] 6.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的 多菌灵浸泡30min后移栽至大棚的耕作土中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为 22 ~28。。。
[0013] 本发明的应用效果：
[0014] 由于本发明的化学消毒组培方法，是利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭 菌或抑菌的作用。所以，配制的培养基是无需高温高压灭菌。因此，对巨芒愈伤组织诱导培 养、分化培养、生根培养各个阶段的影响，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率 的问题。
[0015] 1.愈伤组织诱导培养：本发明的一种巨芒的化学消毒组培方法与常规的巨芒组 培方法相比，在愈伤组织诱导培养阶段的外植体培养的成活率、污染率和死亡率，如表1所 示，都没有太大差异。
[0016] 表1本发明的化学消毒组培方法对巨芒茎尖诱导培养的影响
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[0018] 2.分化培养：从表2可以看出，本发明的巨芒化学消毒组培方法的每团愈伤组织 平均分化苗数明显高于常规的巨芒组培方法，污染率更低，瓶苗也更壮、更绿。
[0019] 表2本发明的化学消毒组培方法对巨芒增殖倍数和污染率的影响
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[0021] 3.本发明的化学消毒组培方法对巨芒生根率和污染率的影响：在生根过程中，本 发明的化学消毒组培方法与常规的巨芒组培方法相比，结果如表3所示，生根率和污染率 都没有太大差异；从瓶苗的生长状况看，用本发明的方法，巨芒组培苗茎更粗，叶片更大，叶 色浓绿。
[0022] 表3本发明的化学消毒组培与常规组培的巨芒瓶苗生根情况比较结果
[0025] 4.成本分析：本发明的化学消毒组培方法与常规组培的成本分析见表4。
[0026] 本发明的化学消毒组培方法省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作 效率。从可以直接计算出来的费用来算，每年可以节约5万元左右（以每天配制50L培养 基计算）。另外，还有一些不容易计算的项目，如高压锅维修，安全，节约空间等：
[0027] 表4本发明的巨芒简便组培方法培养与常规组培的成本分析表
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[0029] 由于本发明的培养基不需要进行高温高压灭菌，一方面可以降低巨芒组织培养对 设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，节约了投资成本，电能 消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展巨芒脱毒种苗生产，组培环节大为简 化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，