重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种在毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽 的方法，具体为重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及生理活性鉴定方法。
【背景技术】
[0002] Lunasin是一种含有43个氨基酸的新型多肽，首次从大豆种子中分离鉴定。研究表 明lunasin具有很多特别的生理活性，包括抗癌和抗炎等。除此以外，专利201510224932.9 公开了 lunasin能够通过PPAR通路抑制小鼠前体脂肪细胞(3T3-L1)分化而具备潜在的减肥 活性。然而，在天然作物中，Lunasin的含量较低，从中分离纯化Lunasin步骤繁琐，且得率较 低，这使得大多关于Lunasin活性的研究都以昂贵的合成Lunasin为原料而限制其进一步研 究及应用。
[0003] 目前，国内尚无关于如何利用基因工程方法，将Lunasin基因片段克隆转载到毕赤 酵母中，经过诱导表达和纯化步骤生产出高活性真核表达Lunasin的报到。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表 达、纯化以及生理活性鉴定方法，其利用基因工程方法，将Lunasin基因片段克隆转载到毕 赤酵母中，经过诱导表达和纯化步骤生产出高活性真核表达Lunasin。
[0005] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0006] -种重组lunas in多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，包括以下步骤：
[0007] 1)重组表达质粒的构建
[0008] 设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR 扩增获得目的基因片段。将目的基因片段用限制性内切酶EcoR I酶和Not I酶进行双酶切， 然后将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物 用T4DNA连接酶连接，通过热激转化到大肠杆菌DH5a中培养扩增，提取得到重组表达质粒 pPIC9K_lunasin;
[0009] 2)筛选高抗性重组基因工程菌株
[0010] 将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经Sac I线性化酶切，将经酶切线性化的重组表 达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例12yL: 80yL混合后，进行电击转化获得转化子， 将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重 组工程菌 GS115/pPIC9K-lunasin;
[0011] 3)重组luansin多肽的发酵生产
[0012] 将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株GS115/pPIC9K-lunasin接种 于BMGY培养基中，在30°C下培养直至0D6QQ为2.0-4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于 BMMY培养基中培养直至0D6Q()为1.0-2.0，0.5%甲醇诱导表达;经甲醇诱导重组lunasin多肽 的发酵液高速离心除去细胞后，上清液使用Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳，鉴定出分 子量5KDa左右的重组lunasin多肽特征条带，以筛选得到高表达lunasin多肽的基因工程菌 株；
[0013] 4)重组luansin多肽的分离纯化
[0014]将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经高速离心 除去菌体后，上清中加入CaCl2溶液，充分混匀后室温静置5min，高速离心得到沉淀，该沉淀 经真空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物；
[0015]将粗产物以浓度为1 Omg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰时间分部分收 集洗脱液，真空干燥后，经Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳，收集lunasin多肽富集洗脱 液，合并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干燥后得到纯度为93%的重组lunasin多 肽。
[0016] 优选地，上述技术方案中，步骤1)中设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序 列为：
[0017] GAA TTC TCC AAA TGG CAG CAC CAG CAA GAC AGC TGC CGC AAG CAG CTC CAG GGG GTG AAC CTC ACG CCT TGC GAG AAG CAC ATC ATG GAG AAG ATC CAA GGC CGC GGC GAT GAC GAT GAT GAT GAT GAC GAC GAC GCG GCC CTACTACTACTG CTG CTG CGC CGG。
[0018] 优选地，上述技术方案中，步骤1)中特异性扩增引物为：
[0019] 上游引物：5'-GGAATT CTC CAA ATG GCA GCAC-3'，
[0020] 下游引物：5'-TT GGC CGC GTC GTC GTC ATC ATC-3'。
[0021] 优选地，上述技术方案中，步骤2)中感受态毕赤酵母GS115制备方法包括以下步 骤：
[0022] 从YPD平板上挑取一个新鲜的毕赤酵母GS115单克隆至10ml YPD液体培养基，30 °C，250rpm培养过夜；测定过夜培养物的OD600值为3.0-5.0之间；将10ml YPD过夜培养物稀 释至0D600值为0.2-0.4;在28-30°C摇床中继续培养8-12h，使其0D6Q()值达到1.0-1.5;于室 温1500g离心5min收集酵母细胞，弃上清；用10ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500g离心 5min离心收集细胞，弃上清；用lml山梨醇溶液重悬酵母细胞，以每管50μ1分装。
[0023] 优选地，上述技术方案中，步骤2)中经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤 酵母GS115细胞按比例12yL: 80yL混合后进行电击转化。
[0024] 优选地，上述技术方案中，步骤3)中：
[0025] BMGY培养基配方为：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，1.34 % YNB，4 X 10-5 %生物素， 1 · 0%甘油，10 · 0% (v/v)pH6 · 0磷酸缓冲液；
[0026] BMMY培养基配方为：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，1.34 % YNB，4 X 10-5 %生物素， 0 · 5 %甲醇，10 · 0 % (v/v) pH6 · 0磷酸缓冲液。
[0027]优选地，上述技术方案中，步骤3)中诱导表达时间为60h，每隔24h补充甲醇至终浓 度为0.5%。
[0028] 优选地，上述技术方案中，步骤3)中Trish-Tricine SDS-PAGE蛋白电泳条件为： 40V 40min，85V 240min，电泳环境保持在4°C。
[0029] 优选地，上述技术方案中，步骤4)中上样量为5mL，平衡液为含有EDTA的pH 6.8?83，流速4111171^11，洗脱液为謂他(：1浓度梯度30%-50%，每81^收集一管。
[0030] 优选地，上述技术方案中，步骤4)中CaCl2溶液初始浓度为1M，终浓度为10-20mM。
[0031] 优选地，上述技术方案中，步骤4)中收集洗脱液过lOKDa超滤膜，收集滤出液，再过 lKDa超滤膜，收集浓缩液。
[0032] 优选地，上述技术方案中，步骤4)中HPLC检测条件为:分离柱为C18(4 · 6mm*250mm， 5um)，检测器为UV检测器，检测波长为215nm，流速为lmL/min，A相0.1%三氟乙酸水溶液3 相为0.1 %三氟乙酸乙腈，线性梯度:B相15%~35%，20min。
[0033] -种根据上述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达及纯化方法获得的纯 化的重组lunasin多肽的活性鉴定方法，包括以下步骤：
[0034] 将3T3-L1前体脂肪细胞以10000个细胞/mL密度接种于12孔板，生长融合后，再培 养48h，加诱导液I，所述诱导液I包含10%FBS，1%双抗，1 Oμg/ml胰岛素，0.5m MIBMX和0.1μ M DEX的DMEM培养基培养;培养48h后更换为诱导液Π ，所述诱导液Π 包含5μg/ml胰岛素的 DMEM培养基培养;培养48h后更换为含有50μg/ml重组Lunasin多肽的DMEM培养基，并以5yg/ ml罗格列酮作为阳性对照组，不加 lunasin作为空白对照组，继续培养48h后，10%甲醛缓冲 液固定4h，油红染色lh，显微镜下观察脂滴堆积状况，并使用lmL异丙醇提取，在492nm下测 定吸光度。
[0035] 本发明上述技术方案，具