一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 枯草芽孢杆菌（SaciWiAs 具有非致病性和分泌蛋白能力强等特性，广 泛运用于农业、医药和工业酶制剂等领域。利用枯草芽孢杆菌生产的酶制剂有淀粉酶、蛋白 酶、脂肪酶、纤维素酶和纳豆激酶等，提高其发酵酶活力常用的方法有理化诱变筛选新菌株 或是利用基因工程手段增加相关目的基因的表达。因而深入了解枯草芽孢杆菌胞外酶合成 的调节机制，对枯草芽孢杆菌高产酶菌株的选育将大有裨益。
[0003] 已有研究认为，枯草芽孢杆菌胞外酶的大量合成是在细菌生长经过对数生长期后 菌体生长进入减速期和随后的稳定期内发生的。然而，在细菌生长进入稳定期后，菌体细胞 会先后启动芽孢形成相关基因的表达，而先期启动芽孢形成相关基因表达的细胞，同时也 会启动产孢致死因子（sporulation killing factor，Skf)基因（sAf)的表达，从而杀死那 些尚未启动芽孢形成相关基因的菌体和对表达敏感的营养细胞，以使先期启动芽孢形 成相关基因表达的细胞获得足够营养并延迟芽孢的形成，这一结果最终导致活体细胞数目 和菌体生物量的降低，这种现象称为同类相残。正是由于这一现象的存在，使得枯草芽孢杆 菌胞外酶产量受到了根本限制，而目前尚无较好的改进方式。
【发明内容】
[0004] 在对现有同类相残现象研究基础上，本发明提出了一种改造枯草芽孢杆菌菌株的 方法，该方法主要是通过基因工程手段敲除产孢致死因子基因（?々/)从而构建新的产酶菌 株从而规避同类相残现象发生，同时具有较好提高枯草芽孢杆菌胞外酶产量的效果。
[0005] 本发明所采取的技术手段详细介绍如下。
[0006] -种改造枯草芽孢杆菌菌株的方法，该方法包括如下步骤： (1)人工构建不含(敲除）产孢致死因子基因（?々/)的基因序列， 所述不含(敲除）产孢致死因子基因的基因序列，3173bp，由3部分DNA片段组 成，分别是上游部分序列（片段A，SEQ ID NO. 1)、四环素抗性基因表达序列（片段B，SEQ ID NO. 3)、i/S因下游部分序列（片段C，SEQ ID NO. 2);(需要说明的是，序列表中序列有 重叠部分，具体计算时需要去除两条序列中其中一条相互重叠部分的序列） 具体过程如下： A. 提取总DNA，利用DNA提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌基因组的总DNA备用； B. 片段A (?々/上游部分序列）的PCR扩增，以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌基因组 的总DNA为模板，根据枯草芽孢杆菌基因组序列（GenBank序列号CP010052. 1)设计如下引 物： PLSr -TGCGCTGACGTCGATTACCTGGGTTGGTGCGTTA-3r ； P2, 5r -CTGTCAAACATGAGAATTACGTGTCATAGCAATACT-3r ； P2引物中Y端的CTGTCAAACATGAGAATT部分序列属于与片段B(四环素抗性基因表达 序列）接头处的重叠区域； PCR扩增，扩增产物经电泳并提取回收备用； C. 片段B (四环素抗性基因表达序列）的PCR扩增，以质粒pBR322为模板，根据质粒 的序列设计引物如下： P3, 5r -AGTATTGCTATGACACGTAATTCTCATGTTTGACAG-3r ； P4，5' -TATCAAACACTAATCCAAGTCACCCGAGATGCGCC-3'; P3引物中Y端的AGTATTGCTATGACACGT部分序列属于与片段A (i/上游部分序列） 接头处重叠区域； P4引物中Y端的TATCAAACACTAATCCAA部分序列属于与片段C UA/基因下游部分序 列）接头处重叠区域； PCR扩增，扩增产物经电泳并提取回收备用； D. 片段C (?々/基因下游部分序列)的PCR扩增，以步骤A所提取的枯草芽孢杆菌基因 组的总DNA为模板，根据枯草芽孢杆菌基因组序列（GenBank序列号CP010052. 1)设计如下 引物： P5，5' -GGCGCATCTCGGGTGACTTGGATTAGTGTTTGATA-3'; P6,5， -TCCGGACCCGGGCCATAAAAGTAATAGAAACACAGTAAAG -3，； P5引物中Y端的GGCGCATCTCGGGTG部分序列属于与片段B (四环素抗性基因表达序 列）接头处的重叠区域； PCR扩增，扩增产物经电泳并提取回收备用； E. PCR融合，将步骤B、步骤C、步骤D所制备的PCR扩展产物进行PCR融合，融合PCR 进行三轮，具体过程如下： 第一轮融合PCR，以片段A、片段B为模板，不添加引物进行PCR扩增； 第二轮融合PCR，在第一轮PCR反应液中添加片段C进行扩增； 第三轮融合PCR，在第二轮PCR反应液中添加引物Pl和引物P6,扩增产物经电泳并提 取回收备用； 经过三轮融合后的PCR扩增产物即为人工构建的不含(敲除）产孢致死因子基因（ 的基因序列； (2)电击转化， 将步骤（1)中所构建不含(敲除）产孢致死因子基因（?々/)的基因序列电击转化枯草芽 孢杆菌感受态细胞，获得转化子； (3)筛选验证， 对所构建的枯草芽孢杆菌菌株，筛选、验证获得敲除产孢致死因子基因正确转化菌株。
[0007] 所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌WB800。
[0008] 利用所述改造枯草芽孢杆菌菌株方法所构建的枯草芽孢杆菌菌株，在淀粉酶制备 中的应用，可以提高淀粉酶产量。
[0009] 现有技术中，对于产孢致死因子基因（虽然已有部分基础研究，但通过敲除产 孢致死因子基因是否可以提高内源酶产量则是未知数，同时对于不同微生物菌株，敲除产 孢致死因子基因后对于菌株发酵能力的改进是否相同更是缺乏研究。本发明以具体的枯草 芽孢杆菌菌株为例，成功构建了缺失产孢致死因子基因（·?/)的新菌株，在将该菌株具体用 于发酵生产淀粉酶时，测定结果表明，所构建的新菌株的酶活得到了较好提升，显现出了较 好地应用前景。
【附图说明】
[0010] 图1为人工构建不含(敲除）产孢致死因子基因（if)的基因序列过程中片段Α、 片段B、片段C的PCR产物的电泳图，其中A为片段A电泳图，B为片段B电泳图，C为片段 C电泳图； 图2为融合PCR后所构建的不含(敲除）产孢致死因子基因（sAf)的基因序列的电泳 图，其中1、2为融合片段，为3173bp，M为Ikb plus marker ; 图3为跨基因组DNA与同源重组片段的PCR验证，其中M为Ikb plus marker，1为CK (出发菌株)，2~10为转化子菌株； 图4为对5号转化子的跨基因组DNA与同源重组片段上游序列的PCR验证，其中M为 Ikb plus marker，l为出发菌株以Y1-F/Y1-R为引物的PCR结果，2为出发菌株以Y2-F/ Y2-R为引物的PCR结果，3为5号转化子以Y1-F/Y1-R为引物的PCR结果，4为5号转化子 以Y2-F/Y2-R为引物的PCR结果，5~9为5号转化子以Y1-F/Y2-R为引物的PCR结果； 图5为培养24h后培养液中的活菌数对比图； 图6为转化子菌株和出发菌株淀粉酶活力测定结果对比图。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例对本发明做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中 所用到部分样品简要介绍如下。
[0012] 菌株及质粒 下述实施例中所用枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌WB800,由上海北诺生物科技有 限公司提供； 相关基因操作中所用质粒为质粒PBR322,购自于上海纪宁实业有限公司，其主要是作 为PCR过程中四环素抗性基因的模板。
[0013] 微生物培养过程中所用培养基 下述实施例中培养枯草芽孢杆菌所用培养基主要有液体LB培养基和固体LB培养基两 类，具体配方及制备要求如下： 液体LB培养基：酵母抽提物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g，蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均 匀后分装到500 mL三角瓶中，高压灭菌45 min备用； 固体LB培养基：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂20g，加蒸馏水煮沸并混合 均匀，然后用蒸馏水定容至1000 mL，分装到500 mL三角瓶中，高压灭菌45 min备用。
[0014] 部分试剂与酶 细胞/细菌/酵母基因组DNA提取试剂盒、2XTag Mix、2Xpfu Mix、l kb plus marker，上海莱楓生物科技有限公司产品； Taq MasterMix，购自康为世纪公司； LA TagUOXLA PCRBufferi: (Mg2+ plus)、dNTP Mix，购自 TaKaRa; 电击恢复液RM :海藻糖0. 5M、山梨醇0. 5M、甘油50%、甘露醇