一种长非编码rna及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，特别涉及长非编码RNA uc003hsl. 1在制备治疗非小细 胞肺癌药物的应用。
【背景技术】
[0002] 基因组学研究表明，人类基因组约有20000个蛋白编码基因，约总基因数比例的 2%，其余大多数基因被转录成非编码1?嫩(11〇11-(3〇(1;[1^1^，1101^)。1101^依其长短，可 分为转录起始RNA、Piwi蛋白相互作用RNA，微小RNA、小核仁RNA和长非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)等。LncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸且自身不编码 蛋白的RNA分子。LncRNA起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物，是基因组转录的"噪 音"，不具有生物学功能。然而，最近的研究表明，它们可以通过多种不同的机制、在多种层 面上影响基因的表达水平。LncRNAs调控基因表达的方式存在多样性，表现在IncRNAs依赖 的基因表达调控机制的多样性。在不同机制中，IncRNAs作用不同，既可作为主要的转录调 控因子，又可作为共调控因子之一，与其他组分共同发挥调控作用。IncRNAs对于基因表达 调控的层次大体上可分为：（1)表观修饰水平调控，通过与各种染色质修饰酶相互作用，对 染色质进行修饰，改变其构象，激活或抑制相关基因的表达。尤其在胚胎发育阶段，IncRNAs 参与引起可遗传的等位基因后期表达沉默、表观性状的维持，对于多细胞动物的正常发育 与细胞分化至关重要。（2)转录水平调控，IncRNAs通过调节转录因子的结合与装配，与调 控序列DNA形成三链复合物，调控RNA聚合酶II，转录干扰等方法实现。（3)转录后水平调 控，通过和互补的mRNA形成dsRNA，影响mRNA的加工、剪接、转运、翻译和降解等过程，从而 调苄基因的表达。
[0003] LncRNAs因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热 点。近年来，许多研究显示，某些IncRNAs与相应的人类肿瘤密切相关。通过调控一系列生 物功能或者干扰正常功能，包括转录沉默、可变剪接等方式，IncRNAs在肿瘤的发生发展中 起着重要作用。
[0004] 根据世界卫生组织（WHO)公布的资料显示，肺癌的发病率和死亡率在世界各国均 呈明显上升的趋势，尤其是工业发达的国家。在发达国家，肺癌是最常见的恶性肿瘤之一， 列男性常见恶性肿瘤的第一位，列女性常见恶性肿瘤的第2、3位。20世纪末肺癌已占恶性 月中瘤死亡的首位。非小细胞肺癌占所有肺癌的80%，可分为腺癌、鳞癌、大细胞肺癌等。许 多肺癌患者在诊断时已发生转移，往往失去手术机会，而针对肺癌的化疗方案效果亦欠佳， 五年生存率低于5%，亟需寻找新的、有效的治疗肺癌的方法。随着基因工程研究的深入，科 学家对运用基因工程研制肿瘤药表现出浓厚的兴趣。发明人发现lnc-uC〇03hsl. 1在治疗 非小细胞肺癌方面具有很好应用前景。
[0005] Lnc-uc003hsl. 1是一条长度为2216nt的IncRNA，是由发明人提供正常肺组织与 肺癌组织标本，由博奥生物有限公司进行芯片制备筛选出的在肺癌组织中显著高表达的 RNA。Lnc-uc003hsl. 1由发明人首次发现并命名，具有新颖性。
【发明内容】
[0006] 技术目的
[0007] 本发明的目的是提供lnc_uc003hsl. 1在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
[0008] -种长链非编码RNA，其核苷酸序列为Seq NO. 1。
[0009] 所述一种长链非编码RNA在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
[0010] lnc-uc003hsl. 1 干扰序列（5' to 3'）：CCAGATGGGCACTTCTAAA，见 Seq NO. 2 GCTGCTAGTATTGTTCTTT，Seq NO. 3。
[0011] 技术方案
[0012] 设计特异性的针对lnc-uC〇03hsl. 1的干扰序列，以干扰GAPDH基因的序列片作为 对照，并将其插入慢病毒载体中（以上载体及片段由irwitrogen公司合成）。将包装好的 慢病毒载体感染非小细胞肺癌细胞株A549细胞，起到下调lnc-UC〇03hsl. 1表达的作用， 48h后用G418筛选稳定转染细胞系。
[0013] 一、lnC-uC〇03hsl. 1促进非小细胞肺癌化疗敏感性的基础验证试验
[0014] (一）：lnc-uc003hsl. 1在正常肺组织与肺癌组织中的表达情况
[0015] 1.芯片制备及分析：按照博奥生物有限公司的要求准备正常肺组织与肺癌组织 标本，交由博奥生物有限公司进行芯片制备，晶芯:?人类长链非编码RNA芯片VI. 0版本完 成芯片分析。
[0016] 2.芯片结果：实验数据来自博奥公司，结果如图1及表格1所示
[0017] 3.结果分析：lnc_uc003hsl. 1在肺癌中的表达量较正常肺组织中上调了 32. 13 倍；提示lnc-uc003hsl. 1在肺癌中可能作为一个癌基因发挥作用。
[0018] (二）：qRT_PCR分析lnc-uc003hsl. 1在正常肺上皮细胞株16HBE与非小细胞肺 癌细胞株A549中的表达量
[0019] L 方法：Trizol 试剂提取细胞总 RNA，qRT-PCR 运用 SYBR Green PCR Master Mix(TAKARA，大连，中国），人GATOH作为内参。
[0020] 2. qRT-PCR结果：如图2所示。
[0021] 3.结果分析：lnc-uc003hsl. 1在16HBE中低表达，在A549中高表达，与基因芯片 结果一致。
[0022] 二、lnc_uc003hsl. 1对非小细胞肺癌细胞凋亡、增殖、药物敏感性的影响
[0023] 实验一：细胞凋亡实验
[0024] 1.流式细胞仪检测细胞凋亡：构建lnc-uc003hsl. 1慢病毒干扰载体转染A549细 胞株（A549/sh-lnc-uc003hsl. 1)，空载体转染A549细胞株（A549/lnc-NC)设为对照组。将 这些细胞株种在6孔板上，3 X IO5个细胞/孔。每组给予顺铂或多西他赛处理，48h后流式 细胞术测细胞凋亡水平。
[0025] 2.结果测定：如图5、6所示。
[0026] 3.结果分析：与对照组相比，转染lnc_uc003hsl. 1慢病毒干扰载体后，给予顺铂 或多西他赛处理均出现细胞凋亡增多，提示降低lnc-uC〇03hsl. 1表达可促进非小细胞肺 癌细胞的凋亡。
[0027] 实验二：细胞周期检测
[0028] 1.流式细胞仪检测细胞周期：构建lnc-uC〇03hsl. 1慢病毒干扰载体转染A549细 胞株（A549/sh-lnc-uc003hsl. 1)，空载体转染A549细胞株（A549/lnc-NC)设为对照组。将 这些细胞株种在6孔板上，3 X IO5个细胞/孔。每组给予顺铂或多西他赛处理，24h后流式 细胞术测细胞周期。
[0029] 2.结果测定：如图7、8所示。
[0030] 3.结果分析：A549转染lnc-uc003hsl. 1慢病毒干扰载体后与对照组相比，给予顺 铂或多西他赛处理均出现细胞周期Gl期阻滞增加，提示降低lnc-uC〇03hsl. 1表达可抑制 非小细胞肺癌细胞的增殖。
[0031] 实验三：细胞耐药相关实验
[0032] I. MTT测细胞IC50 :构建lnc-uc003hsl. 1慢病毒干扰载体转染A549细胞株 (A549/sh-lnc-uc003hsl. 1)，空载体转染A549细胞株（A549/lnc-NC)设为对照组。将这些 细胞株种在96孔板上，2500个细胞/孔。每组给予顺铂或多西他赛处理，给药3天后MTT 染色法检测细胞活力，进而计算各自的药物IC50。
[0033] 2.结果测定：如图3、4所示。
[0034] 3.结果分析：在A549细胞株中，给予DDP处理的sh-lnc-uc003hsl. 1实验组 IC50 :13. 05ug/ml，对照组 IC50 (NC) :24. 87ug/ml ;给予 DTX 处理的 sh-lnc-uc003hsl. 1 实验组IC50:17. 92ug/ml，对照组IC50 (NC) : 24. 78ug/ml。观察到此现象，提示降低 lnC-uC〇03hsl. 1表达可以促进非小细胞肺癌细胞凋亡，提高细胞化疗敏感性。
[0035] 三、蛋白免疫印迹实验检测lnc-uc003hsl. 1对非小细胞肺癌细胞株