一种蛋白质样品结晶筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白质样品结晶筛选方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质结晶是蛋白质以晶体形式从溶液中析出的过程，它不仅为蛋白质的高级结构与功能等的研究提供了适宜的样品，例如制备供X-射线衍射分析用的样品，而且为较高纯度的蛋白质的获得和应用创造了条件。
[0003]影响蛋白质结晶的因素很多，主要有蛋白质的纯度和浓度、结晶温度、结晶时间、PH值、盐离子浓度、金属离子等，结晶条件的筛选无规律可循，需要对结晶条件进行大量的不断的尝试和摸索，并且一种成功的结晶条件一般只对几种甚至一种蛋白质有效，因此筛选蛋白质结晶条件，尤其是筛选能够满足X-射线衍射分析用的高质量晶体的结晶条件相当困难。
[0004]微流控技术是现今国际高新科技前沿领域之一，在蛋白质结晶及其筛选研究中的应用取得了快速发展，已逐渐成为蛋白质结晶微型化研究最有潜力的发展方向之一。它采用微机电技术加工出具有微米尺度通道网络结构的芯片，通过对芯片中皮升至纳升级微流体的操纵和控制，实现生物医学和化学实验室的集成化分析检测功能。滑动芯片(SlipChip)技术就是微流控技术的一种，由具有微结构的上下两块基片组成，下层基片加工蛋白质样品引入通道和用于储存待筛选沉淀剂的微腔，上层基片加工待筛选沉淀剂的引入通道和用于储存蛋白质样品的微腔，实验中通过上下基片相互滑动的方法，使上层基片各微腔中的蛋白质溶液分别与下层基片中各微腔内的沉淀剂接触，形成很多个密闭的结晶反应室。
[0005]但是现有的滑动芯片未见圆形，不易固定和操作；未能实现同时进行多参数的系统性结晶条件筛选；且未有滑动芯片提及可以实现原位结晶条件的优化。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供了蛋白质样品结晶筛选方法，该筛选方法操作简便，可实现多个参数组合进行筛选，有效地实现了批量筛选过程，大大降低了试验操作强度，而且节约了样品和试剂的消耗量，降低了实验成本。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0008]—种蛋白质样品结晶筛选方法，其特征在于:该筛选方法采用玻璃材质的筛选器，
[0009]所述筛选器包括相互贴合的下底板和上转板，上转板呈圆形，可绕圆心作包括指定三个角度的旋转，在下底板的上贴合面上开设各种开口向下的凹槽流道、微腔，在上转板的下贴合面上开设各种开口向上的凹槽流道、微腔，以及一些进、出口通孔，所述的凹槽流道、微腔可由化学蚀刻方式开设，且均为微米级；
[0010]所述上转板旋转三个角度之一，起始点凹槽位置:
[0011]所述下底板和上转板上开设的凹槽流道、微腔，以圆心为中心，呈幅射状排列L个形状相同的扇形单元，每个扇形单元由中心向周边分割为M个径向小单元，每个径向小单元又由N个微单元组成；优选的，所述L = 8?15、M = 4?8、N = 4?8。
[0012]进一步优选的，所述L为10。
[0013]所述扇形单元的左右两侧分别开设从圆心向圆周走向的蛋白质进样通道和从圆周至圆心的沉淀剂进样通道。所述通道俯视呈首尾相接的S字形，分别有与周向方向一致MXN个横式的蛋白质微腔和沉淀剂微腔，每对蛋白质微腔和沉淀剂微腔位于同一直径处，交替在微腔左右两侧有与径向方向一致的引入流道。
[0014]将蛋白质样品进样口设于圆心处，将蛋白质样品出样口设于圆周边；另一侧通道的沉淀剂进样口进口位设于圆周边，沉淀剂出样口位于圆心处；两个进口和两个出口均位于上转板且为通孔；当一侧通道的微腔位于下底板上，则该微腔两侧的引入流道位于上转板上，在该位置上、下板上的凹槽相互流通；此时，另一侧通道的微腔位于上转板上，该微腔两侧的引入流道位于下底板上，上、下板上的凹槽也相互流通，构成蛋白质进样通道和沉淀剂进样通道；
[0015]每个扇形单元中的蛋白质微腔随所处位置半径增大体积不变，但径向宽度变小、弧长变长；各径向小单元的沉淀剂微腔随所处位置半径增大按一定关系变大；
[0016]所述上转板旋转三个角度之二，继续旋转进入滑动控制点凹槽1:
[0017]所述扇形单元两侧通道的微腔与引入流道错位，凹槽相互阻断，此时，各组的蛋白质微腔和沉淀剂微腔在弧长上有部分重合形成密闭的结晶反应腔；
[0018]在此位置，选择部分相邻两个结晶反应腔为一组，在该组两结晶反应腔之间的下底板上开设径向的蛋白质浓度调节通道，所述蛋白质浓度调节通道径向两端与两结晶反应腔之间留有h距离，相邻两结晶反应腔位于上转板的微腔，在位于蛋白质浓度调节通道的旋转上游位置各相向伸出一段衔接流道，衔接流道的长度大于等于h，在位于两衔接流道之间开设蛋白质浓度调节孔，该孔为通孔，通孔外表备有密封盖；
[0019]所述上转板旋转三个角度之三，如发现微腔中存在蛋白质沉淀或微晶体，继续旋转进入滑动控制点凹槽I1:
[0020]两衔接流道与蛋白质浓度调节通道径向接通，所述蛋白质浓度调节孔位于蛋白质浓度调节通道的上方。
[0021]其筛选方法分为:
[0022](A)、将上转板旋转至起始点凹槽位置，固定下底板和上转板，形成蛋白质样品溶液引入通路和沉淀剂溶液引入通路；向蛋白质样品进样口注入蛋白质样品溶液，向沉淀剂进样口注入沉淀剂溶液，使得各通路充满溶液；
[0023]在沉淀剂筛选实验中，蛋白质样品进样口只注入一种蛋白质样品溶液，不同的沉淀剂进样口可注入不同的沉淀剂溶液，形成多因素交叉筛选；
[0024](B)、将上转板旋转至起凹槽I位置，固定下底板和上转板，微腔与引入流道错位，储存蛋白质样品的微腔与储存沉淀剂的微腔相连，形成若干个适合结晶的密闭反应腔，反应腔内进行结晶反应；
[0025]各反应腔中分别具有不同的结晶条件，包括沉淀剂种类、蛋白质样品与沉淀剂比例(即蛋白质样品的浓度)和结晶速率，间隔一定时间后对芯片中各结晶反应腔内的结晶情况进行观察，确认是否有结晶出现，以此筛选结晶条件或决定是否要对结晶条件进行一步优化。
[0026]由于蛋白质水溶液化学势高于沉淀剂的化学势，蛋白质样品溶液中的水分子进入沉淀剂，实现蛋白质样品溶液达到过饱和状态，使得蛋白质样品从溶液中逐渐析出，形成晶体。而蛋白质样品与沉淀剂接触通道长度直接影响了蛋白质样品溶液达到过饱和的速率，即影响了晶体形成的速率，此速率较大程度影响着晶体形成的概率及其质量。
[0027](C)、确认反应腔中是否有结晶出现，如出现结晶，则筛选结果完成；如步骤⑶中的某个反应腔中出现沉淀或具有多个微小的晶体，需重新结晶，继续转动上转板。
[0028](D)、将上转板旋转至起凹槽II位置，固定下底板和上转板，蛋白质样品浓度调节孔、蛋白质样品浓度调节通道与结晶反应腔接通；向蛋白质样品浓度调节孔中加入超纯水，以密封盖密封蛋白质样品浓度调节孔，超纯水的化学势偏高，超纯水扩散至结晶反应腔中，沉淀或微晶体全部溶解；
[0029](E)、将上转板旋转至起凹槽I位置，固定下底板和上转板，使结晶反应腔与蛋白质样品浓度调节通道分离，结晶反应腔再次呈密闭状态，结晶反应腔中进行结晶反应。
[0030](F)、确认反应腔中是否有结晶出现，如出现结晶，则筛选结果完成；如步骤(E)中的某个反应腔中出现沉淀或具有多个微小的晶体，需重新结晶，重复步骤(D)和(F)。
[0031]由于超纯水的扩散，在结晶反应腔中，整个反应体系的溶液浓度降低，使得蛋白质样品溶液趋于过饱和状态的进程放慢，即蛋白质结晶速率进程变慢，让获得更大体积且晶形更加完整的蛋白质晶体成为可能。
[0032]所述扇形单元中M个径向小单元沉淀剂微腔的容积之比为一等比数列。优选的，所述M为5，5个沉淀剂微腔的容积之比，随所处位置半径变小依次为4:2:1:0.5:0.25。
[0033]所述所述蛋白质结晶反应的反应温度为4°C或25°C。
[0034]所述固定下底板和上转板的方法为，在上转板的上方配置转动环，所述转动环为在一圆环上固定四根垂直圆环面的细针，在上转板上开设相应的针孔，