一种小麦旗叶特异表达的启动子及其应用

文档序号:9919779阅读:716来源:国知局
一种小麦旗叶特异表达的启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程和植物遗传育种领域,特别涉及小麦旗叶特异表达基因 NAC transcription factor I(NAM-Bl)的启动子及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物是人类赖W生存和发展的物质基础,植物生产是第一性的生产,植物品种是 植物生产的物质基础,改良植物品种的过程称为植物育种。植物基因工程和植物遗传育种 相结合是现代农业的发展方向。获得具有优质,高产,高抗病抗逆性和其它特殊性状的植物 品系是农业发展的目标和推动力,将转基因技术应用于植物遗传育种是现代植物育种技术 发展的新动力,转基因技术就是将人工分离和修饰过的外源基因导入到目的生物体的基因 组中,从而达到改造生物性状的目的。
[0003] 在该技术中的关键环节是要将外源基因置于合适的启动子之后才能引导该基因 在目的生物体基因组中表达。启动子是指位于功能基因上游的一段能使基因进行转录的脱 氧核糖核酸值NA)序列。启动子可W被RNA聚合酶辨认,并起始转录,启动子在决定基因表 达的时空模式中起着主要的作用。目前常用的转基因启动子主要是泛素(Ubiquitin)启动 子和烟草花叶病毒35s启动子等组成型表达启动子,对于小麦转基因,该类启动子可W有 效地诱导外源基因在小麦中表达,但是该类启动子诱导外源基因的表达没有器官和组织的 特异性,在小麦的各个器官和组织该启动子都会诱导外源基因表达,送就限制了该启动子 的应用价值,我们进行转基因育种时通常需要将我们导入的外源基因在小麦特定的发育阶 段和器官表达,送是该类启动子所无法实现的。
[0004] 本发明中我们从野生二粒小麦基因组中分离了小麦旗叶特异表达基因 NAC transcription Tactorl(NAM-Bl)的启动子序列,小麦NAM-Bl基因属于植物NAC转录因子 基因家族,该基因在旗叶特异表达,将该启动子应用于转基因小麦,可W诱导功能基因在小 麦旗叶特异的表达。利用送一启动子的送种功能,我们可W提供一种在转基因小麦的旗叶 中特异表达外源基因的方法,为现代遗传育种技术的发展提供新的动力。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种能够特异诱导外源基因在小麦旗叶表达的启动子。
[0006] 为了送一目的,本发明人从野生二粒小麦基因组中分离了小麦旗叶特异表达基因 NAC transcription Tactorl(NAM-Bl)的启动子序列,小麦NAM-Bl基因属于植物NAC转录 因子基因家族,该基因在旗叶中特异性表达。本发明人将分离得到的启动子应用于转基因 小麦,成功地诱导了功能基因在小麦旗叶中特异性表达。
[0007] 由此,在本发明的第一方面,本发明提供一种小麦旗叶特异表达的启动子,所述启 动子是由SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列组成或者是将SEQ ID No. 1所示的核巧酸经过一 个或几个碱基的取代、缺失、添加所衍生的能够特异诱导外源基因在小麦旗叶特异表达的 核巧酸序列。
[0008] 优选地,所述启动子的核巧酸序列为SEQ ID No. 1。
[0009] 在本发明的第二方面,本发明提供包含SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列作为启动 子的表达盒,所述表达盒能够使连接在所述表达盒中的目的基因在小麦旗叶中特异性表 达。
[0010] 优选地,本发明提供包含上述表达盒的重组载体,所述重组载体能够使连接在所 述重组载体中的目的基因在小麦旗叶中特异性表达。
[0011] 优选地,所述载体是能够在小麦中表达的载体,例如PCAMBIA1301载体。
[0012] 送种载体可W是农杆菌双元表达载体或者通过其它方式转入受体植物基因组的 植物表达载体,在该启动子后面添加需要在小麦旗叶中特异表达的外源基因的编码核巧酸 序列,诱导该基因在小麦旗叶中特异表达。也可W通过在编码序列的下游导入各种表达标 签来表达纯化蛋白。另外根据具体的实验材料和方法还可W在载体上添加不同的抗性基因 来应对不同的筛选方式。
[0013] 在本发明的第H方面,本发明提供SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列或包含SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列作为启动子的表达盒或重组载体在小麦育种的应用。在所述应用 中,将用于改良小麦性状的外源功能基因连接到所述表达盒或重组载体中,使其处在所述 启动子的控制下进行表达,然后将连接有所述外源基因的所述表达盒或所述重组载体转染 到小麦植株中,从而使得所述外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达,筛选具有所述外源 功能基因的功能的转基因小麦,进而起到改良小麦性状的作用。具体地说,可W改良小麦对 光合作用产物的利用率。例如在旗叶特异表达光合产物的输出基因,可W提高光合产物的 输出效率,从而增加小麦产量,但本发明并不限定于此种应用。
[0014] 在本发明的第四方面,本发明提供一种培育小麦品种的方法,所述方法包括将用 于改良小麦性状的外源功能基因连接到本发明第二方面所述的表达盒或重组载体中,使所 述外源功能基因处在本发明第一方面所述的启动子的控制下进行表达,然后将连接有所述 外源基因的所述表达盒或所述重组载体转染到小麦植株中,从而使得所述外源功能基因在 小麦旗叶中特异性表达,然后筛选具有所述外源功能基因的功能的转基因小麦,进而起到 改良小麦性状的作用。
[0015] 本领域技术人员应该理解,如果外源功能基因不是小麦来源的,为了使其在小麦 中充分表达,可W按照小麦密码子应用偏好进行密码子优化,在不改变外源功能基因所编 码的氨基酸序列的前提下,优化其核巧酸序列使其能够在小麦中充分表达。关于密码子优 化的技术是本领域技术人员所熟知的。另外,关于将表达盒或重组载体转染到小麦植株中 的方法也是本领域的常规方法,例如,可W利用农杆菌介导的转染技术等。
[0016] 在本发明的第五方面,本发明还提供包含本发明第二方面所述的表达盒或重组载 体的重组细胞,其中所述细胞选自微生物细胞或真菌细胞,例如,但不限于,大肠杆菌细胞, 农杆菌细胞等。
【附图说明】
[0017] 从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
[001 引 图 1 ;根据 Triti州m turgidum ssp. Dicoccoides (野生二粒小麦)克隆 BAC409D13 (NCBI序列号DQ871219),设计特异引物分离克隆了旗叶特异表达基因 NAM-Bl的 启动子序列(I. 5化)凝胶电泳检测。泳道I为分子量标记,其他泳道为NAM-Bl启动子序列 的PCR扩增产物。
[001引图2 ;小麦NAM-Bl基因启动子诱导GUS基因表达的农杆菌转化载体Pwam : :GUS 构建示意图。
[0020] 图3 ;T。代转基因小麦PCR鉴定结果。泳道1、2、4、5、6、7为转基因阳性植株;泳道 3为转基因阴性植株;泳道8为阴性植株对照;泳道9为W水为模板的PCR负对照。
[00川图4 ;转基因小麦Pnam Bi : :GUS不同器官和组织的GUS染色结果。a ;Pnam Bi : :GUS 旗叶;b ;野生型旗叶;C =Pnam BI : :GUS 根;d =Pnam BI : :GUS 茎;e =Pnam BI : :GUS 营养叶。
【具体实施方式】
[0022] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明,但是本领域技术人员应该理解,本发 明并不限于送些具体的实施例。
[0023] 下述实施例中的实验方法,如果没有特殊说明,均为常规实验方法。实验所用到的 试剂盒实验仪器,如无特殊说明,均可在生物仪器和试剂公司购买到。
[0024] 实施例1.小麦NAM-Bl基因启动子诱导GUS基因在小麦旗叶中特异表达
[00巧]1 根据 Triti州m turgidum ssp. dicoccoides (野生二粒小麦)克隆 BAC409D13 (NCBI序列号DQ871219),设计特异引物分离克隆了旗叶特异表达基因 NAM-Bl的 启动子序列(1. 5化)(图1)。
[0026] 2小麦NAM-Bl基因启动子诱导GUS基因农杆菌重组表达载体Pwam Bi : :GUS的构建
[0027] NAM-Bl启动子用加 NotI酶切位点的上游引物和加 PvuII酶切位点的下游引物 扩增,PCR产物回收后,与pGEM-Teasy载体(购自promega公司)连接,测序正确后得到 pGEM-NAM-Bl载体,再通过酶切,连接,转化的方法将NAM-Bl启动子插入到农杆菌转化载体 B52(中国科学院遗传与发育生物学研究所,可参见Binary Agrobacterium vectors for plant transformation,M Bevanin,Nucleic Acids Research(1984)12(22) :8711-8721。) 的gus基因上游,得到M : :GUS农杆菌重组表达载体。图2所示为构建的农杆菌重组 表达载体Pnam Bi : :GUS示意图;
[002引 3 W东融法将重组表达载体Pwam ei :GUS转入农杆菌EHA105 (中国科学院遗传与发 育生物学研究所);
[0029] 3. 1挑取农杆菌EHA105单菌落于2ml YEP培养基(1升YEP培养基成分;酵母提取 物Ig(购自OXOid公司),蛋白腺IOg(购自OXOid公司),藏糖5g(购自北京化工厂公司), M拆〇4. 7&0 1. 027g(购自北京化工厂公司),调整PH为7. 0。含化f2 Omg/ml (购自inalco 公司))中28°C过夜活化;
[0030] 3. 2取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28°C生长至0D600约等于0. 5左 右(4虹);
[0031] 3. 35k ;rpm 离必 5 分钟;
[0032] 3. 4在IOml 0. 15M化Cl中悬浮细胞;
[003引 3. 55k巧m离必5分钟,悬浮细胞于20ml冰预冷的化化,即制得农杆菌感受态细 胞;
[0034] 3. 6加 Iug DNA于200ul农杆菌感受态细胞中,冰上放置30分钟;
[0035] 3. 7液氮中冷冻I分钟;
[0036] 3. 837C水浴融化农杆菌细胞;
[0037] 3. 9加 Iml YEP培养基,28 °C摇床培养2-4虹(低速);
[003引 3. 10离必1分钟,悬浮农杆菌细胞在IOOul YEP培养基中;
[003
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