一种cd40胞外区的表达纯化及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，更具体地，本发明设及一种CD40胞外区的表达纯化及 其用途。
【背景技术】
[0002] CD40-CD4化信号通路是免疫系统激活的辅助信号之一，抗原递呈细胞激活T细胞 免疫不仅需要TCR M肥抗原肤信号，还需要、CD28-B7等共刺激信号，CD40-CD4化信号增加 B7. 1、B7. 2分子表达。CD40不仅在B细胞、DC细胞、巨隧细胞等抗原递呈细胞中表达，还广 泛表达于内皮细胞、肥大细胞，成纤维细胞，肿瘤细胞，平滑肌细胞表面。运也提示着CD40 具有广泛的功能，除了前续提到的抗原递呈作用，它还参与辅助性T细胞启动和细胞毒性T 细胞功能，在B细胞发育和抗体类型转换时也发挥重要作用等等。
[0003] CD40-CD40L信号通路在1型糖尿病、多发性硬化症、炎症性肠炎（I抓）、牛皮癖、关 节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫病中是过度激活的，阻断该信号通路已经在相应小鼠模 型中（NOD小鼠、EAE小鼠、I抓小鼠、CIA、SLE小鼠）被证明可W减轻病理作用。 W04]目前阻断该信号通路的主要策略是应用针对CD40L的抗体，其中包括 Ruplizum油度G9588)和Toralizumab (IDEC-131)，它们早在21世纪初就进入临床研究， Ruplizum油在二期临床治疗SLE和肾脏移植中显现出疗效。但是它们都因为并发血管栓 塞而没能实现应用。治疗思路相应转移到针对CD40的单抗研究上，ch5D12正在进行克罗 恩病（化ohn' S disease) -期和二期临床试验，另一个CD40单抗HCD122也在进行治疗MM 和化L的一期临床研究。 阳0化]综上，鉴于CD40-CD4化信号通路与多种疾病存在相关性，本领域迫切需要进一步 针对CD40-CD4化信号通路加 W研究，开发W该信号通路为突破口的新型治疗手段或治疗 药物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种CD40胞外区的表达纯化及其用途。
[0007] 在本发明的第一方面，提供CD40蛋白氨基端胞外区的用途，用于制备抑制肿瘤或 抑制炎症的药物组合物。
[0008] 在一个优选例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外区是CD40蛋白第21-193位氨基酸 序列的蛋白。
[0009] 在另一优选例中，所述的肿瘤是淋己瘤。
[0010] 在另一优选例中，所述的炎症是肠炎。
[0011] 在另一优选例中，所述的淋己瘤是弥漫型大B细胞淋己瘤。
[0012] 在另一优选例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外区是不包含CD40蛋白第20位脯氨 酸的蛋白。
[0013] 在另一优选例中，所述的药物组合物还用于：阻断CD40-CD4化信号通路；阻断 CD40介导的非经典NF- K B信号通路的激活讯/或降低细胞内原癌基因 cMYC的表达。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种CD40蛋白氨基端胞外区，其是CD40蛋白第21-193 位氨基酸序列的蛋白；较佳地，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] 在本发明的另一方面，提供一种多核巧酸，其编码所述的CD40蛋白氨基端胞外 区；较佳地，其核巧酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示。
[0016] 在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤或抑制炎症的药物组合物，其含有 所述的CD40蛋白氨基端胞外区。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体，其中包含有所述的多核巧酸。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种重组酵母细胞，其中包含有所述的多核巧酸或含 有所述多核巧酸的重组表达载体。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种重组表达CD40蛋白氨基端胞外区的方法，所述方 法包括：
[0020] (1)提供一重组表达载体，其包含CD40蛋白氨基端胞外区的编码序列，所述的 CD40蛋白氨基端胞外区是CD40蛋白第21-193位氨基酸序列的蛋白；
[0021] (2)将（1)的重组表达载体转化酵母细胞，获得重组酵母细胞；
[0022] (3)培养（2)的重组酵母细胞，从而表达CD40蛋白氨基端胞外区。
[0023] 在一个优选例中，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
[0024] 在另一优选例中，所述的CD40蛋白氨基端胞外区的编码序列的核巧酸序列如SEQ ID NO:2中第16-537位所示（即密码子优化后的序列）。
[0025] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0026] 图UCD40胞外端基因克隆和鉴定。人CD40胞外段基因 PCR扩增后琼脂糖凝胶检 :右侧条带为CD40-N基因条带，左边条带为DNA marker :DL2000,每孔上样均为5y 1。
[0027] 图2、pPIC9K-CD40-N(巧构建后化Ol NotI双酶切鉴定：左边泳道为基因大小分子 标记（Marker)，剩下的8条泳道均为质粒酶切后的样品，Marker上样5 y 1，其余上样9 y 1/ 孔。
[0028] 图3、酵母菌株表达CD40-N和Western blot鉴定（至少S次实验重复）。
[0029] (A)酵母菌株甲醇诱导表达SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色结果，泳道1为 Marker,左侧为分子量大小对照，0,12......84小时分别为不同时间样品，单位kD，样品 20 y 1/孔，SDS-PAGE浓缩胶5 %，分离胶12 % ;
[0030] 度）各个时间点样品Western blot, P为转染CD40的肥K293T细胞样品，作为阳 性对照。
[0031] 图4、CD40-N表达菌株高密度发酵和表达分析（至少S次实验重复）。
[0032] (A)酵母发酵生长曲线，纵坐标为吸光度0D600读数，横坐标为时间；
[0033] 度）不同时间点发酵液上清蛋白SDS-PAGE电泳：左边泳道为蛋白Marker,泳道 1-14 分别为 0、4、12、16、20、24、32、36、40、48、56、61 小时样品，蛋白样品用 SXloading 煮沸 10分钟后每孔上样14 y 1，Marker上样5 y 1/孔，单位kD，SDS-PAGE胶：浓缩胶5 %，分离 胶 12%。
[0034] 图5、蛋白纯化和糖基化分析（至少=次实验重复）。
[0035] (A)凝胶过滤层析图（S巧hadex G-50)，Y轴为0D280皿吸收值，X轴为流过层析柱 的体积（单位：ml)，蓝色线为样品0D280nm吸收值值，红色为0D254nm吸收值；
[0036] (B)离子交换层析图怕Se地arose Fast Flow)，XY轴与A图相同，垂直线为标记， 标记线后开始0-1. OM化Cl线性洗脱，箭头处为目标蛋白洗脱下来位置；
[0037] (C) SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图，各泳道名称见上面标注，M表示Marker, 1-1、 1-2、1-3分别表示第一个吸收峰收集的=管，左侧为分子量大小，单位kD ; W38] 值）糖肤酶F (PNGase巧处理样品后SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果，M表示 Marker, CON为对照组，PNGaseF为糖肤酶F处理组，PNGaseF组中35kD处为糖肤酶F (细箭 头标识）。SDS-PAGE中样品上样量为Marke巧y 1/孔，样品20 y 1/孔，单位kD，SDS-PAGE 浓缩胶5%，分离胶12%。
[0039] 图6、CD40N阻断CD40-CD4化信号通路（至少S次实验重复）。
[0040] (A) CD40-N可W阻断G28-5对于BJAB细胞中非经典NF- K B信号通路的激活， G28-5 为 lug/ml，CD40N 为 lOug/ml，* 为非特异性带； 阳OW 度）不同浓度的CD40-N可W阻断CD40-L激活的非经典NF-KB信号通路，0.1、1、 10 分别表不 0. 1、1、lOug/ml，CD40-L 为 lug/ml。
[0042] 图7、CD40N可W减少病人来源的DLB化细胞存活。左图为病人来源的DLB化细胞 (PDC)体外不加入和加入骨髓来源的基质细胞度MSC) W及加入和不加入CD40-N后培养后 进行流式检测结果（左上角图为不加入BMSC和CD40-N，左下角图加入BMSC，右上角图加入 CD40-N，右下角图加入BMSC和CD40-N);右图左图的量化结果，CD40-N为lOug/ml。至少S 次实验重复，**P<〇. 01。
[0043] 图 8、CD40-N 抑制 DLB(X 值iffuse large B-cell lymphoma)肿瘤组织块体内生 长。 W44] (A)病人来源的淋己瘤组织移植到裸鼠肾囊膜下，经过5次传代稳定。取一只裸鼠 体内淋己瘤组织块移植到10只裸鼠肾囊膜下，1周后将带瘤老鼠分为两组，一组腹腔注射 PBS，一组注射CD40-N，每周S次，20mg/kg，2个月肿瘤块如图；
[0045] 度）肿瘤重量比较（*p<0. 05, **p<0. 01);
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