高催化活性的基因改造梭菌属神经毒素的利记博彩app
【专利说明】高催化活性的基因改造梭菌属神经毒素 相关申请
[0001] 本申请要求W2013年8月21日提交的美国临时专利申请号61/868,560为优先权基 础，所述优先权文件的所有内容及公开都W引用方式被纳入本申请中。
[0002] 本申请引用了多篇参考文献及出版物。所述参考文献及出版物的所有内容都W引 用方式被纳入本申请中W便更能全面地描述与本发明相关的现有技术。
技术领域
[0003] 本发明设及包括肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的梭菌属神经毒素的改造， W及运些神经毒素及其衍生物的用途。
【背景技术】
[0004] 梭菌属神经毒素 (Clostridia Neurotoxins ,CNTs)是其中一种最毒害人类的蛋白 毒素。例如，肉毒杆菌神经毒素(Botulinum化urotoxin，BoNT)会引起弛缓性麻搏并导致肉 毒中毒，破伤风神经毒素(Tetanus化urotoxinJeNT)则会引发疫李性麻搏。梭菌属神经毒 素的分子量约150kDa，是一个具有典型A-B链-结构/功能特性的双链蛋白，其中B区域(结合 区域)与哺乳动物细胞的表面分子先结合，A区域(活性区域)随后转位至细胞内的位置(1). 梭菌属神经毒素由Ξ个功能区域组成:N-末端的催化区域(轻链，LC)、中间的转运区域(重 链，HCT)及C-末端的受体结合区域(重链，HCR) (2)。梭菌属神经毒素属于锋金属蛋白酶，能 够切割SNARE蛋白（Soluble N-ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment REc邱tor，可溶性NSF附着受体），SNARE蛋白干扰突触小泡与质膜融合，最终阻止神经细胞 分泌神经传导物质（1，3)。哺乳动物神经元的胞吐作用是由一种SNARE蛋白质复合物所带 动，该蛋白质复合物由囊泡SNARE蛋白囊泡相关膜蛋白-2(vesicle associated membrane protein-2，VAMP2)W及两种质膜SNARE蛋白，SNAP25(分子量为25kDa的突触体相关蛋白 Synaptosome-Associated Protein)和突触融合蛋白 la(syntaxin la)所形成（4) eBoNT共 有屯个血清型(血清型A-G)能切割Ξ种SNARE蛋白其中一种的某些特定氨基酸残基:BoNT血 清型B、D、F和G及TeNT能切割VAMP2，BoNT血清型A及E能切割SNAP25,和BoNT血清型C能切割 SNAP25和突触融合蛋白1曰(3,5-7)。
[0005] BoNTs最被广泛使用于蛋白治疗。早在1989年，BoNT血清型A(BoNT/A)经美国食品 和药物管理局(FDA)批准用于治疗斜视、眼险疫李、面肌疫李，也可用于颈部肌张力障碍、化 妆品、眉间面部线条及蔽窝多汗症。由于BoNT血清型A对治疗肌张力障碍和其他与不随意肌 活动有关的毛病有效，并且符合安全性，BoNT血清型A在眼科、胃肠道科、泌尿外科、骨科、皮 肤科、分泌及痛症各个领域已被批准作为实验性使用或药品标示外使用(8-17)"FDA于2000 年12月11日批准肉毒杆菌神经毒素血清型B(MY0BL0C?)用于治疗患有颈部肌张力障碍的患 者，W减少与此病相关的头部位置异常和颈部疼痛的严重性(18，19)。
[0006] BoNT对治疗不随意肌的疫李及收缩、美容或其它应用只有暂时性的效果，因此需 要重复注射BoNT。在一些患者中，BoNT可诱发针对BoNT毒素的中和抗体的产生，并降低BoNT 的可用性。由此引起的免疫耐药性限制了 BoNT的成效，或会使病人对进一步治疗毫无反应 (9，10，20-26)。虽然患者对BoNT治疗产生免疫耐药性的确切百分比不详，但相比BoNT血清 型B的治疗，通常较少患者对BoNT血清型A的治疗产生免疫耐药性（9,26)。运可能是由于 BoNT血清型A复合物所使用的剂量比BoNT血清型B复合物的较低(27) dBoNT中和抗体多见于 接受颈部肌张力障碍或疫李治疗的患者，运是由于治疗此病症需要更大剂量的毒素和定期 给药。至于治疗喉张力障碍、眼险疫李的患者或化妆品用途，由于需要较小的BoNT剂量，中 和抗体不太常见(9，28，29)。降低治疗剂量或有助减少产生BoNT治疗的免疫耐药性。
[0007] 迄今为止仍未有方案能有效处理BoNT免疫耐药性的问题。过往曾有研究试图阻堵 设及诱导中和抗体的BoNT表位。研究人员将取自耐药患者的中和抗体与BoNT血清型A和 BoNT血清型B的不同区域的反应，从而确定一系列可能设及诱导中和抗体的免疫原区（39- 41)。有报告指肤与单甲氧基聚乙二醇(m阳G)缀合能抑制针对肤的免疫反应。BoNT血清型A 的重链区域化C/A)有较强的免疫反应，研究人员将BoNT/A重链与mPEG缀合，并在小鼠接受 BoNT/A治疗前施用该缀合物W进行预先免疫。结果显示，某些mPEG缀合物减少了中和抗体 的产生(42)，表示该预先免疫程序或可临床应用于免疫耐药的患者。
[0008] 由于BoNT的治疗特性和免疫耐药性相互关联，改造 BoNT成为更高活性的毒素 W降 低其治疗所需剂量是克服免疫耐药性最好的方法。Rummel等人将BoNT血清型B重链区域中 用来结合神经节巧脂的模序修改，相比原型毒素，改造后的毒素的结合和毒性提升高达Ξ 倍(43)。然而，BoNT的受体结合区域经改造后有可能影响结合作用的选择性。此外，改造结 合区域不一定可W显着增加毒素的效力W避免产生免疫耐受性。相反，改造轻链化C)W改 变BoNT活性或更有助于避免产生免疫耐受性。因此，有必要改造梭菌属神经毒素，如肉毒杆 菌神经毒素，W提高其治疗效果。 发明概述
[0009] 本发明提供了调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性的方法。
[0010] 在一个实施例中，本发明的方法通过提升毒素的催化活性W增强破伤风神经毒素 轻链化C/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链化C/B)的底物识别。
[0011] 在一个实施例中，本发明提供肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的衍生物及其 应用。
[0012] 在一个实施例中，本发明提供破伤风神经毒素轻链化C/T)的衍生物或整个破伤风 神经毒素的衍生物，运些衍生物的活性被更改。
[0013] 在一个实施例中，本发明提供破肉毒杆菌神经毒素轻链化C/T)的衍生物或整个肉 毒杆菌神经毒素的衍生物，运些衍生物的活性被更改。
[0014] 在一个实施例中，本发明所述的肉毒杆菌神经毒素轻链化C/B)的衍生物或肉毒杆 菌神经毒素衍生物可W在各种治疗、化妆品或其它应用中使用。在另一个实施例中，本发明 所述的肉毒杆菌神经毒素轻链化C/B)的衍生物或肉毒杆菌神经毒素衍生物用于治疗减少 肉毒杆菌神经毒素的免疫耐药性。
[0015] 在另一个实施例中，本发明提供了使用肉毒杆菌神经毒素 W改善当前的疗法的方 法。在另一个实施例中，本发明提供了將肉毒杆菌神经毒素的衍生物或肉毒杆菌神经毒素 的轻链衍生物应用于各种治疗或美容用途的方法。
【附图说明】
[0016] 图1所示的为破伤风神经毒素轻链化C/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链化C/B)的S2'， Sr和S1 口袋，W及VAMP2的P位点。图1显示了位于口袋并与VAMP2不同P位点交互的氨 基酸残基。图1A示出的是LC/T和VAMP2产生相互作用的残基，其中LC/TW表面模型来表示。 图1B示出的是LC/T和VAMP2产生相互作用的残基，其中LC/TW卡通模型来表示。图1C示出的 是LC/B和VAMP2产生相互作用的残基，其中LC/BW表面模型来表示。图1D示出的是LC/B和 VAMP2产生相互作用的残基，其中LC/BW卡通模型来表示。W下为VAMP2的P位点和LC/T的 S2 '，Sr和S1 口袋的命名方法：形成VAMP2可切键的两个残基从C-末端到N-末端被命名为 Ρ1-ΡΓ。从P1到C-末端方向的残基被指定为P2，P3等，而从ΡΓ到N-末端方向的残基被指定 为P2 '，P3 '等。识别特定P位点的LC/T或LC/B口袋W相应的…袋命名。识别VAMP2的P2 '位点 (即E78)的LC/T和LC/B S2 ' 口袋分别由R374和R3?组成。识别VAMP2的ΡΓ位点（即F77)的LC/T 和LC/B S1' 口袋分别由L23哺I227组成。识别VAMP2的P1位点（即矿6)的LC/T和LC/B S1 口袋分 别由Kiss肥和Eiss肥组成。
[0017] 图2所示的為LC/T、LC/B及其衍生物裂解VAMP2的催化活性。图2A示出的為LC/T及 其衍生物裂解VAMP2的活性。图2B示出的為LC/B及其衍生物裂解VAMP2的活性。误差线为每 个实验重复Ξ次的标准差。
[001引图3所示的為LC/B、LC/T及LC/T衍生物比16?，。3叫]的S Γ 口袋残基的方位。图3A比 较位于sr 口袋的残基LC/B(I2")、LC/T(L2w)及1〔/1'[1(16化，。 3叫](12^)的方位。其中线表示 肤的主链骨架，而棒则表示残基。图3B示出的为sr 口袋的相对平坦的位置，当中包括LC/B 的I2"(黑色)及LC/T的比16?，。3叫]的(灰色）。图3C所示的为LC/T的sr 口袋的隆起表面 (W网状曲面来表示），当中包含L2^。图3D所示的为LC/T的sr 口袋的隆起表面m固定表面 来表示），当中包含L2^。
[0019 ]图 4所示的为LC/T (图 4A)、LC/B (图 4B)及LC/T [ k168E，L2呵](图 4C)的 S Γ 和S2 ' 口袋 中残基之间的距离。sr残基侧链和S2'残基侧链之间的距离使用PyM化程式测量。LC/T的 R37哺L23哺者之间的距离约7.2 A:，LC/B的R37哺I22哺者之间的距离约巧也LC/T[k168E, 。3叫]的I23哺R37哺者之间的距离约S 3先。
[0020] 图5所示的为重组LC/B、LC/T及其衍生物裂解内源性VAMP2的结果。图5A显示LC/T 及LC/T[k168E，L23叫]裂解内源性VAMP2的结果。图5B显示LC/B及LC/B[sWi門裂解内源性 VAMP2的结果。在每个图中，上图所示的是分析VAMP2裂解的蛋白印迹结果，当中使用针对 VAMP2的抗体和针对肌动蛋白的抗体。下图则表示蛋白印迹分析的量化结果。
【发明内容】
[0021] 为了提高BoNT的治疗效果及减少诱导BoNT的中和抗体，将BoNT改造成为更强力的 衍生物是非常有用的，运可W减低BoNT于各种治疗及应用中的有效剂量。
[0022] 通过研究肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的底物识别及特异性，本发明将肉 毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素改造成新的衍生物，W提高其活性和底物特异性。
[0023] 本发明中对肉毒杆菌神经毒素轻链化C/B)和破伤风神经毒素轻链化C/T)的底物 识别口袋中的活性部位进行比较和分析。
[0024] 在一个实施例中，本发明提供了通过提升催化活性W优化破伤风神经毒素轻链 化C/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链化C/B)的底物识别。
[0025] 在一个实施例中，本发明提供了调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性 的方法。
[0026] 在一个实施例中，本发明提供增强了活性的肉毒杆菌神经毒素轻链化C/B)的衍生 物或整个肉毒杆菌神经毒素的衍生物。在一个实施例中，本发明所述的肉毒杆菌神经毒素 包含SEQ ID NO.: 1的多肤。在另一个实施例中，本发明所述的肉毒杆菌神经毒素衍生物的 氨基酸序列带有一个或多个改变。在一个实施例中，肉毒杆菌神经毒素的衍生物包含位于 SEQ ID N0.:1第201位的氨基酸的改变，所述氨基酸由丝氨酸serine(swi)改变为脯氨酸 proline(pwi)。在另一个实施例中，肉毒杆菌神经毒素衍生物[s^i門包括SEQ ID N0.:2的 序列。
[0027] 在一个实施例中，肉毒杆菌神经毒素的衍生物包括位于SEQ ID NO. :1第263位的 丙氨酸alanine的改变。在另一个实施例中，肉毒杆菌神经毒素的衍生物包括位于SEQ ID NO. : 1第264位的异亮氨酸isoleucine的改变。
[0028] 在一个实施例中，本发明提供破伤风神经毒素轻链化C/T)的衍生物或整个破伤风 神经毒素的衍生物。在一个实施例中，本发明所述的破伤风神经毒素包括SEQ ID NO. :3的 多肤。在另一个实施例中，本发明所述的破伤风神经毒素衍生物的氨基酸序列带有一个或 多个改变。在一个实施例中，破伤风神经毒素的衍生物包含位于SEQ ID NO. :3第230位的氨 基酸的改变，所述氨基酸由亮氨酸leucinea2^)改变为异亮氨酸isoleucin