去除α-半乳糖的方法
【专利说明】去除α-半乳糖的方法
[0001 ] 本申请根据35USC§119要求2013年11月3日申请的美国临时申请案第61/899,647号的优先权，且该案是全文以引用方式并入。
[0002]本披露大体上涉及制备和使用缺乏一些或全部半乳糖α-l，3-半乳糖表位的组织基质的方法。
[0003]使用各种组织源产品来修复、再生、治愈或以其他方式治疗患病或受损组织和器官。这些产品可包括完整组织移植物和/或部分或完全脱细胞组织。这些组织产品可从多种供体来源提供，包括从受体(即，自体移植物)、从相同物种的另一成员(即，同种异体移植物)或从不同物种(即，异种移植物)采集的组织。尽管自体移植物和同种异体移植物可降低因在供体组织中物种特异性蛋白质的表达所致的排斥的可能性，但那些供体来源在手术使用时可能不实用或不能提供足够材料。
[0004]因此，可寻找替代性异种移植物来源。异种移植的一个问题在于，供体可在组织中表达受体不表达的酶或其他蛋白质，从而提尚排斥的可能性。例如，不表达酶UDP-半乳糖:β-D-半乳糖基-1，4-N_乙酰基-D-氨基葡糖苷α-l，3-半乳糖基-转移酶(“α-l，3半乳糖基转移酶”或“aGT”，其催化末端二糖半乳糖α-l，3半乳糖(“α-gal” )的形成)的动物(例如，人类或其他灵长类动物)对来自在组织移植物中的细胞表面上表达a-gaI表位的动物(例如，猪或其他非灵长类哺乳动物)的异种移植物可展现增加的免疫反应和超急性排斥。
[0005 ]从组织产品消除α - g a I表位可减小针对该组合物的免疫反应。U.加利尔(U.Galili)等人，生物化学杂志(J.B1l.Chem.)263:17755(1988)。因此，需要从计划用于植入不表达α-gal表位的受体(例如，人类)中的供体组织去除α-gal表位的方法。
[0006]因此，在各个实施例中，披露从脱细胞组织去除α-gal的方法。所述方法可包括选择至少一种含有半乳糖α-l，3-半乳糖部分的含胶原组织基质;并且使所述至少一种组织基质与至少一种蛋白分解酶在足以从该组织去除半乳糖α-l，3_半乳糖部分的条件下接触。
[0007]所述酶可包括阿尔卡拉酶(alcalase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、分散酶或胰蛋白酶。且该方法可进一步包括实施分析以确定是否已从至少含胶原组织基质去除了半乳糖α-1,3-半乳糖部分。
[0008]还提供使用这些方法产生的组织产品。另外，提供使用所述组织产品的治疗方法或通过所披露方法产生的组织产品。进一步提供酶处理的组织产品。组织产品可包括从野生型猪含胶原组织制备的无细胞组织基质，其中该含胶原组织已使用并非特异性针对半乳糖α-l，3_半乳糖部分的蛋白酶进行酶处理以从组织去除基本上全部半乳糖α-l，3_半乳糖部分。在一些实施例中，组织基质来自产生α-半乳糖的非灵长类动物，且组织基质已经进一步加工以从该含胶原组织基质基本上或完全去除α-半乳糖。
[0009]至少一种含胶原组织基质可含于细胞组织内，且该方法可进一步包括使该细胞组织脱细胞。在一些实施例中，组织基质被完全脱细胞;且组织基质可包含无细胞基质。
[0010]在一些实施例中，蛋白分解酶去除半乳糖α-l，3_半乳糖部分且不损伤所述至少一种组织基质。
[0011]在一些实施例中，分析包括测量半乳糖α-l，3_半乳糖部分的浓度。分析可包括组织化学分析或免疫分析。
[0012]蛋白酶可包括阿尔卡拉酶和胰蛋白酶中的至少一种，并且蛋白酶是以在约0.0001 %到约0.1 %范围内的浓度且在约0.5小时到约24小时范围内的时间段中使用。蛋白酶还可包括菠萝蛋白酶和分散酶中的至少一种，且蛋白酶是以在约10单位/升到约200单位/升范围内的浓度且在约I小时到约24小时范围内的时间段中使用。该方法可进一步包括使组织与α-半乳糖苷酶接触。
[0013]至少一种含胶原组织基质可包含来自以下中的至少一种的组织基质:骨骼、皮肤、脂肪组织、真皮、肠、膀胱、腱、韧带、肌肉、筋膜、脉管、神经、血管、肝、心脏、肺、肾和软骨组织。组织可从一种或多种不同动物或组织来源获得。至少一种含胶原组织基质可为猪组织基质，例如猪无细胞真皮组织基质。
[0014]该方法可进一步包括将一种或多种组织相容的活细胞添加到组织产品中，例如哺乳动物细胞，包括哺乳动物干细胞。
[0015]在一些实施例中，将至少一种选自以下的其他因子添加到组织产品中:消炎剂、止痛剂、细胞生长因子、血管生成因子、分化因子、细胞因子、激素和趋化因子。至少一种其他因子可由含于表达载体内的核酸序列编码，该表达载体可含于一种或多种组织相容的活细胞内。
[0016]该方法可进一步包括处理至少一种含胶原组织基质以降低生物负荷。处理至少一种含胶原组织基质以降低生物负荷可包括辐照组织产品。
【附图说明】
[0017]图1Α-1Η是黑白图，其图解说明根据实例I的方法，未处理猪无细胞真皮(未使用酶去除α-gal)和经菠萝蛋白酶、阿尔卡拉酶和胰蛋白酶处理的猪无细胞真皮样品的针对α-gal部分的免疫组织化学染色结果，所述样品各自经α-半乳糖苷酶处理及未经α-半乳糖苷酶处理。
[0018]图2图解说明保留在作为未处理对照的无细胞真皮基质和经各种酶处理的无细胞真皮基质中的α-gal百分比的抑ffjljELISA测量的结果。
实施方式
[0019]现在将详细地参考根据本披露的某些示例性实施例，这些实施例的某些实例展示于附图中。
[0020]在此使用的小节标题仅是为了编排的目的并且不应该被解释为对所述主题进行限制。在本申请中所引用的所有文件或文件的部分，包括但不局限于专利、专利申请、论文、书籍、和专著，都特此出于任何目的通过引用将其全部内容清楚地结合在此。如果以引用方式并入的出版物和专利或专利申请案与说明书中所含的
【发明内容】
相矛盾，那么说明书将取代任何矛盾内容。
[0021]在本申请中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。同样，除非另外说明，否则在本申请中，“或”的使用意指“和/或”。另外，术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不具限制性。本文所述的任何范围都将理解为包括端点和端点之间的任何值。
[0022]本文披露通过去除一些或全部α-gal表位制备在人类或非人类灵长类动物中植入时具有降低免疫原性的组织产品的方法。可使用多种人类或其他动物组织和多种方法来制备所述组织产品。例如，组合物可通过以下方式来制备:选择猪组织;任选地使组织脱细胞以产生含胶原组织基质；和将组织暴露至在足以去除所需量的α-gal部分的时间段和浓度下的一种或多种蛋白酶，例如阿尔卡拉酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和/或分散酶。在一些实施例中，可在暴露至蛋白酶后测量和/或确认α-gal部分的去除。在某些实施例中，酶可包括并非α-半乳糖苷酶、即对α-半乳糖裂解无特异性的酶。
[0023]在各个实施例中，组织产品可包含完整组织、部分或完全脱细胞组织基质和/或已经一种或多种细胞接种的脱细胞组织。在一些实施例中，一些或全部α-gal表位的去除可通过以下方式来确认:例如，直接测量并比较经蛋白酶处理的组织产品样品表面上的α-gal浓度与未处理组织中的浓度。在一些实施例中，去除可通过比较经蛋白酶处理的组织中的免疫反应和/或炎症反应与未处理组织中的反应来确认。
[0024]如本文所用术语“组织基质”是指三维胶原和蛋白质结构，其形成形状和取向类似于在天然组织中发现的胶原和蛋白质网络的形状和取向的纤维网络。可从天然组织中去除细胞以提供无细胞组织基质。
[0025]根据各个实施例，可使用本文提供的材料和方法来制造组织产品，该组织产品是生物相容性植入体(例如，生物相容性组织移植物)。如本文所用“生物相容性”植入体是能支持天然细胞从周围组织迀移到经植入组织产品中并增殖和/或能在不诱导显著免疫反应的情况下植入的植入体。如本文所用术语“天然细胞”和“天然组织”