一种内生枯草芽孢杆菌及其作用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株枯草芽抱杆菌及其应用，主要应用于植物病害的生物防治方面， 该枯草芽抱杆菌可W用于括抗魔芋软腐病、水稻白叶枯病。
【背景技术】
[0002] 软腐病俗称"半边疯"，是魔芋生产上危害最严重的病害。魔芋软腐病属软腐欧文 氏菌属（Erwinia)，是一种革兰氏阴性细菌，胡萝h软腐欧氏杆菌胡萝l·软腐亚种 化1'讯；[]11日。日1'01：0￥0^3山339.。日1'01：0￥0^)，栽培期及胆藏期可发病，影响产量和品质。魔芋 种植业每年因软腐病损失巨大。
[0003] 水稻白叶枯病又称白叶攝、茅草攝、地火烧等是水稻主要病害病原菌为水稻白叶 枯黄单胞杆菌(Xanthomanas oryzae pv.oryzal Dye),属黄单胞杆菌属细菌。主要特征为 病株叶尖及边缘初生黄绿色斑点，后沿叶脉发展成苍白色、黄褐色长条斑，最后变灰白色而 枯死，造成釉谷和碎米，导致减产甚至绝收，对产量影响较大。
[0004] 几个世纪W来，化学农药在植物病虫害的防治中发挥了巨大作用，为农业的增产、 稳产和提高品质做出了重要贡献。但是由于过量施用和滥用农药导致地力衰退和环境污 染。尤其近几年来由于农药残留超标，严重影响了人们的生活质量。在当前农作物无公害栽 培中，微生物农药越来越受到重视。因为它们不仅防治病虫害的效果好，而且对环境友好、 对农作物无污染，病虫对其不易产生抗药性。因此，在生物农药中，W微生物农药用途多、应 用前景最为广阔。
[0005] 芽抱杆菌属的细菌为好氧或兼性厌氧的杆菌，广泛分布在水、空气和±壤中。芽抱 杆菌在抱子状态下稳定性好，能耐氧化;耐挤压;耐高溫，能长期耐60°C高溫，在120°C溫度 下能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可W耐唾液和胆汁的攻击，是饲料 微生物中可100%直达大小肠的活菌。同时本品具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少 抗生素药物的使用，增强免疫力的优点，因而在生物防止病虫害中起着重要作用。目前芽抱 杆菌属用于防止病虫害主要有:枯草芽抱杆菌、腊状芽抱杆菌、短小芽抱杆菌等。
[0006] 本发明从疏花水柏枝(Myricaria Laxiflora)的健康的叶中分离得到一株内生枯 草芽抱杆菌，它对魔芋软腐病原菌和水稻白叶枯病原菌有很好的抑制作用，为开发新的植 物生防制剂提供技术支撑。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一是提供一种枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl菌株，该枯 草芽抱杆菌对魔芋软腐病原、水稻白叶枯病原有很好的抑制作用，为开发新的生物农药品 种、植物生物防治菌剂提供了新选择。
[000引所述枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl是从疏花水柏枝中获得的，于2014年 5月5日保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCN0: M2014182，保藏地址为中国， 武汉，武汉大学。
[0009] 本发明枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl在LB培养基上具有w下微生物学 特性:菌落近圆形、表面光滑，污白色，菌体杆状，单生或成短链，革兰氏阴性，具芽抱。
[0010] 本发明目的是提供一种用于生物防治植物病害的菌剂和生物农药，其活性成分为 枯草芽抱杆菌MSI或其发酵液。其中所述植物病害为魔芋软腐病、水稻白叶枯病。抑菌试验 表明，枯草芽抱杆菌MSI对魔芋软腐病、水稻白叶枯病原菌具有抑制效果。故可将菌株的发 酵液或菌悬液作为农药的有效成分用于植物病害的生物防治，或者将本菌株制备成菌剂用 于植物病害的生物防治。因而，本发明还包括含有所述菌株或者其发酵液的生物农药，W及 含有所述菌株的微生物菌剂。
[0011] 所述的枯草芽抱杆菌发酵液，制备方法如下：
[0012] 1)菌种活化:取保存于-86°C冰箱的枯草芽抱杆菌菌株菌种接种于LB液体培养基 中，30°C下，200rpm振荡培养12小时，作为种子培养液；
[0013] 2)菌株发酵：将上述种子液W5%(V/V)浓度接种于LB液体培养基中，30°C下， 20化pm振荡培养18小时，获得发酵液，离屯、获得上清液，即为发酵液。
[0014] 本发明W枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl单菌落为模板，使用通用上游引 物27f:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'和通用下游引物1492r:5'-GGTTACCTTGTTT ACG ACT T-3'进行菌落PCR扩增获得lOOObp的16srDNA部分序列（SEQ ID N0:1)。通过Blast 与GenBank收录的序列进行比对，发现MSI与枯草芽抱杆菌的同源性为99%。用MEGA4.1进化 树（图），鉴定菌株(MSI)与一株枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilisKJ469796)的同源性达 97%。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl的菌落形态。
[0016] 图2为本发明的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl的显微形态。
[0017] 图3为本发明的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl发酵液对水稻白叶枯病原 菌括抗作用效果。
[0018] 图4为本发明的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl发酵液对魔芋软腐病病原 菌括抗作用效果。
[0019] 图5为本发明的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl菌株的16S rDNA系统发育 树。
【具体实施方式】
[0020] 实施例一:枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)MSl的分离和保存
[0021] 2012年在Ξ峡流域湖北宜昌境内姻脂巧采集疏花水柏枝叶片，采用稀释平板法从 中获得细菌；
[0022] 制备稀释液:取疏花水柏枝叶lOg，加入lOOmL无菌水中，将组织研磨捣碎。无菌操 作吸取捣碎组织液1. OmL加入9.0血无菌水中，在用无菌水稀释为1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、 ΙΟΛΙΟ-7共7个浓度梯度。
[0023] 培养:取各浓度梯度稀释液10化L分别涂布于LB培养基平板(蛋白腺lOg/L，酵母膏 5g/L，NaCl 1 Og/L，琼脂15g/L，其余为水，pH7.2-7.4，12 rC灭菌20min)中，倒置恒溫箱内30 °c培养。
[0024] 取单菌落:待平板上长出菌落后，根据形态挑取单菌落于lOmL灭菌的LB液体培养 基(蛋白腺1 Og/