来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明设及来自水痘-带状瘤 疹病毒姐蛋白的中和表位肤（或其变体），包含此类中和表位肤（或其变体）和载体蛋白 的重组蛋白，W及此类中和表位肤（或其变体）和重组蛋白的用途。本发明还设及针对此类 中和表位肤的抗体，产生所述抗体的细胞株，W及它们的用途。本发明还设及包含所述中和 表位肤或重组蛋白的疫苗，包含所述抗体的药物组合物，W及它们的用途，例如，它们可用 于预防和/或治疗水痘-带状瘤疹病毒感染或与所述感染相关的一种或多种疾病或症状。
【背景技术】
[0002] 水痘-带状瘤疹病毒（Varicella-Zoster Virus, VZV)属于瘤疹病毒 科化erpesviridae)，α -瘤疹病毒亚科（alpha-herpesviridae)，水痘病毒属 (Varicellovirus)。VZV病毒的基因组为大小约125化的双链DNA，其含有70个开放 阅读框；基因组外为衣壳，衣壳与病毒包膜之间为皮层结构，其间含有许多皮层蛋白；病 毒最外围为病毒包膜，其上至少含有9种膜蛋白狂hang, Z.等人，2010.化oS Pathog 6:e100 0971)〇
[0003] VZV病毒感染可表现出两种不同的临床症状。初次感染主要发生于儿童，临床症 状一般表现为水痘。在初次感染期间，病毒在皮肤上进行复制并扩散侵染皮肤的神经末梢， 其后病毒将延神经轴逆行至背根神经节并建立潜伏。在年老、免疫力衰退或因疾病、药物导 致免疫抑制等情况下，潜伏的病毒将被重新激活，病毒延神经轴顺行至该神经支配的皮肤， 进行大量复制形成病灶，而表现为带状瘤疹狂erboni，L.等人，2014.化t Rev Microbiol 12(3) :197-210)。带状瘤疹常伴随瘤疹后神经痛。瘤疹后神经痛疼痛剧烈，可持续数年之 久，极大影响患者生活质量。带状瘤疹及瘤疹后神经痛的发生概率随年龄增大而增大，运给 老龄化社会造成了较大的社会负担。
[0004] 当前对于VZV病毒感染最主要的预防措施为注射疫苗。当前市面上有水痘 疫苗和带状瘤疹疫苗来分别针对VZV病毒感染引起的两种临床症状度risson，M.等 人，2003. J Med Virol 70 Suppl l:S31-37;0xman，M. N.等人，2005. N 化gl J Med 352(22) :2271-2284)。对于已经发病的个体，当前并没有有效的、特异的治疗手段，而只是 通过抗病毒药物来进行治疗。对于部分因病或因药物导致的免疫抑制者，迅速、特异、有效 地控制病情十分重要。
[0005] VZV病毒包膜蛋白姐是病毒表面含量最多的一种糖蛋白，它对于病毒的复制 是必需的，它与细胞表面的受体膜岛素降解酶的结合被认为在病毒入胞中起着重要作 用，并且，它在VZV病毒的T细胞、皮肤和神经嗜性上发挥重要作用度erar化cci，B.等 人，2010. Proc 化tl Acad Sci USA 107(1) :282-287 ;Moffat，J.等人，2004. J Virol 78 (22) : 12406-12415)。此外，姐还是VZV病毒上免疫原性很强的蛋白，其可激起对病毒的 体液及细胞免疫反应值endouga，N.等人，2012. Vaccine 30(20) :3126-3135)。当前W姐 为主要成分的亚单位疫苗已处于临床试验中，是一种极具有潜力的安全性高的疫苗形式。
[0006] 当前W病毒中和性抗体为基础的抗体治疗已经应用在许多疾病的治疗上。对于 VZV病毒感染的治疗而言，已尝试使用人多抗来进行治疗。然而，多抗特异性不及单克隆抗 体，其治疗效果不能令人满意。因此，发现有效的中和表位和针对其的抗体对于VZV病毒的 治疗（特别是紧急干预）具有重大意义。
[0007] 发明概述
[0008] 为了发现有效的中和表位和针对其的抗体W实现对VZV病毒感染的有效预防和 治疗，本发明人进行了深入的研究。
[0009] 特别地，本发明人通过设计的引物，从VZV病毒（Oka株）基因组中调取了姐蛋白 胞外区段的基因序列，并将其克隆到杆状病毒基因组上；然后，借助昆虫-杆状病毒表达系 统成功表达了重组蛋白r姐。该蛋白可W成功分泌到被感染细胞的培养上清，具有较完整的 翻译后修饰。
[0010] 进一步，本发明人使用亲和层析的方式纯化出了纯度在95% W上的r姐蛋白。随 后，本发明人使用弗氏佐剂对纯化后的r姐蛋白进行乳化，将其用于免疫小鼠，并从免疫的 小鼠制备单克隆抗体。本发明人总共获得70株杂交瘤细胞株，其均能够产生对r姐有特异 性反应的单抗（单克隆抗体）。
[0011] 进一步，本发明人使用基于酶联免疫检测的中和方法对运些单克隆抗体中和病毒 的能力进行检测。结果显示，其中的一株抗体（命名为4A2)能够有效中和病毒，其中和滴 度达到1:2560。该单抗在WesternBlot及免疫巧光上可W与病毒感染的细胞特异性反应， 而对未感染的细胞无反应。
[0012] 进一步，本发明人合成了涵盖姐蛋白全长的多个肤段，并测定运些肤段与4A2抗 体的反应性。结果显示，氨基酸序列为SEQ ID NO: 1-8的表位肤能够与4A2抗体特异性反 应。在将运些肤段与网上数据库中的序列进行比对发现后，运些肤段在100个VZV病毒临 床分离株序列中具有高度保守性（100% )。
[0013] 运些结果显示，本发明人所鉴定到的表位在各种VZV病毒株中是高度保守的，其 可用于制备抗各种VZV病毒株的广谱中和性抗体，可用于诱发机体产生抗VZV的中和抗体， 从而可用作预防和治疗VZV病毒的有效疫苗；并且，所制备的4A2抗体是针对保守表位的补 体依赖的中和抗体，其可用作预防和治疗VZV病毒的药物组合物。
[0014] 因此，在一个方面，本发明提供了来源于水痘-带状瘤疹病毒（VZV)的姐蛋白的 表位肤或其变体，包含所述表位肤或其变体W及载体蛋白的重组蛋白，包含所述表位肤或 其变体W及偶联部分的表位肤偶联物，包含它们的各种形式的组合物，W及它们的用途和 使用方法。
[0015] 此外，本发明还提供了编码所述表位肤或其变体或所述重组蛋白的核酸分子，包 含所述核酸分子的载体，包含所述核酸分子或载体的宿主细胞，W及制备所述表位肤或其 变体或所述重组蛋白的方法。
[0016] 在另一个方面，本发明提供了特异性结合本发明表位肤的单克隆抗体或其抗原结 合片段，包含所述单克隆抗体或其抗原结合片段W及偶联部分的抗体偶联物，包含所述单 克隆抗体或其抗原结合片段的试剂盒和药物组合物，W及它们的用途和使用方法。
[0017] 此外，本发明还提供了编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，包含 所述核酸分子的载体，包含所述核酸分子或载体的宿主细胞，w及制备所述单克隆抗体或 其抗原结合片段的方法。
[0018] 下面将结合附图、发明详述和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本 领域技术人员将理解，下列附图、发明详述和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的 范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对 于本领域技术人员来说将变得显然。
【附图说明】
[0019] 图1显示了重组蛋白r姐的SDS-PAGE的检测结果，W及使用4A2抗体来检测重组 蛋白r姐的Western blot的结果。泳道1显示的是蛋白marker,每一个条带对应的分子 量标示于左边；泳道2显示的是纯化后的重组蛋白r姐的SDS-PAGE的检测结果；泳道3显 示的是使用4A2单抗来检测重组蛋白r姐的Western blot的检测结果。结果显示，抗VZV 姐单克隆抗体4A2可与重组r姐抗原产生特异性反应，可用于检测重组r姐抗原。
[0020] 图2显示了单抗4A2的中和实验结果。将4A2单抗进行两倍倍比稀释（从1:40 开始），然后进行中和实验。结果显示，当单抗稀释度为1:2560时，蓝色斑点数仍然小于阳 性对照斑点数的50 %。因此，单抗4A2的中和滴度为1:2560。
[0021] 图3显示了使用4A2单抗来检测用VZV的Oka病毒株感染的（a)和未经感染的化） ARPE-19的免疫巧光测定的结果。其中，图3a显示的是单抗4A2与VZV感染后的ARPE-19 细胞的免疫巧光反应的结果；图3b显示的是单抗4A2与未感染的ARPE-19细胞的免疫巧光 反应的结果。结果显示，单抗4A2能够有效识别分布于被感染细胞的细胞膜上的姐蛋白， 并且不与未感染VZV病毒的ARPE-19细胞发生反应。
[0022] 图4显示了使用单抗4A2来检测病毒感染细胞的Elispot测定的结果。结果显示， 在Eli spot检测中，感染VZV的病变细胞显出肉眼清晰可见的蓝色斑点（图4的A1-A3)，而 未感染VZV的细胞则不显现蓝色斑点（图4的B1-B3)。运些结果表明，抗VZV姐中和性单 克隆抗体4A2可用于检测VZV病毒的滴度。
[0023] 图5显示了使用单抗4A2来检测VZV病毒感染的皮肤组织的免疫组化测定的结 果。图5A:VZV病毒感染的皮肤组织，其中显示的栋色区域为VZV感染的阳性信号区域；图 5B:未感染的皮肤组织，其中，4A2不与未感染的皮肤组织发生反应（无栋色区域）。运些结 果说明，针对VZV姐的中和性单抗4A2能特异性检测出被VZV病毒感染的皮肤组织，能够 应用于VZV病毒感染的免疫组织化学检测。
[0024] 图6显示，单抗4A2能够捕获和分离杆状病毒表达的重组蛋白r姐。泳道1 :无关 单抗；该泳道的结果显示，无关单抗不能捕获分泌到培养上清中的r姐。泳道2:单抗4A2 ; 该泳道的结果显示，4A2单抗能够捕获分泌到培养上清中的r姐。
[002引图7显示，单抗4A2能够捕获病毒上的天然姐蛋白。在图7A和7B中，泳道1 :未 感染病毒的细胞的裂解上清；泳道2 :感染VZV病毒的细胞的裂解上清。图7A的SDS-PAGE 结果显示，4A2不能捕获未感染VZV病毒的细胞的裂解上清中的任何蛋白（泳道1)，但能够 捕获VZV感染的细胞的裂解上清中的蛋白（泳道2)。并且，图7B的Western blot检测结 果显示，4A2所捕获的蛋白为天然姐蛋白（泳道2)。
[0026] 图8显示了检测单抗4A2与合成的肤之间的反应性的ELISA测定的结果。结果显 示，在所合成的54条肤段中，4A2单抗仅与肤段13具有强反应，而与其他肤段基本上不反 应。运表明，肤段13含有4A2单抗识别的表位。
[0027] 图9显示了表达包含本发明的表位肤和载体蛋白C149的重组蛋白的质粒的构建 流程图。其中，将表位肤的两端连接至接头（linker),然后替换载体蛋白C149的第79-80 位氨基酸。
[0028] 图10显示了纯化后的载体蛋白C149 W及含有表位肤和C149蛋白的重组蛋白所 形成的颗粒的电镜图。其中，图10中，小图皿C显示的是纯化后的载体蛋白C149所形成的 颗粒的电镜图；小图F1至F8显示的是含有表位肤（SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO :8)和C149 蛋白的重组蛋白所形成的颗粒的电镜图。结果显示，所获得的经纯化的蛋白均能够组装成 类病毒颗粒，其呈均匀的空屯、球体结构。
[0029] 图11显示了检测含有表位肤的8个融合蛋白（VZV-姐-FUVZV-姐-F2、VZV-姐-F3、 VZV-姐-F4、VZV-姐-F5、VZV-姐-F6、VZV-姐-F7、VZV-姐-F8)和不含表位肤的载体蛋白 化BcAg)与4A2单抗之间的反应性的Western Blot测定的结果。图11显示的结果为，用 ImageJ软件对印迹条带的灰度值进行定量分析的结果。结果显示，8个含有表位肤的融合 蛋白都能够被4A2单抗特异性识别和结合，而不含表位肤的载体蛋白（皿cAg)不能够与4A2 单抗发生特异性反应。
[0030] 图12显示了使用多抗血清来检测用V-Oka病毒感染的和未经感染的ARPE-19的 免疫巧光测定的结果。结果显示，使用本发明融合蛋白所制备的8种多抗血清都能够结合 VZV Oka毒株感染的ARPE-19细胞，并显示出绿色巧光；而不能识别或结合未感染VZV病毒 的ARPE-19细胞（作为阴性对照）。运些结果说明，抗本发明融合蛋白的多抗血清能够特异 性结合VZV病毒，并因此能够特异性识别VZV病毒感染的细胞。
[00引]发明详述
[0032] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验 室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供 相关术语的定义和解释。
[0033] 如本文中所使用的，术语"姐蛋白"是指，水痘-带状瘤疹病毒（VZV)的姐蛋白， 其是本领域技术人员公知的（参见，例如NCBIGENBANK数据库登录号：Q9J3M8)。
[0034] 如本文中所使用的，当提及姐蛋白（或者其胞外区段）的氨基酸序列时，其使用 SEQ ID NO :121所示的序列来进行描述。例如，表述"姐蛋白的第121-135位氨基酸残基" 是指，SEQ ID NO :121所示的多肤的第121-135位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解， 在姐蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失 和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的姐蛋白），而不影响其生物学功能。因此，在本 发明中，术语"姐蛋白"应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO :121所示的序列W及其 天然或人工的变体。并且，当描述姐蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO :121的序 列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述"姐蛋白的第121-135位 氨基酸残基"包括，SEQ ID NO :121的第121-135位氨基酸残基，化及其变体（天然或人工） 中的相应片段。根据本发明，表述"相应序列片段"或"相应片段"是指，当对序列进行最优 比对时，即当序列进行比对W获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置 的片段。
[003引如本文中所使用的，术语"皿cAg"是指，乙型肝炎病毒化BV)的核屯、抗原蛋白，其 是本领域技术人员公知的（参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：AGA95670. 1)。
[0036] 如本文中所使用的，当提及皿cAg的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO :122所示的 序列来进行描述。例如，表述"皿cAg的第79-80位氨基酸残基是指，SEQ ID NO :122所示 的多肤的第79-80位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在皿cAg的氨基酸序列中， 可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因 型或基因亚型的皿cAg)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语"皿cAg"应包括 所有此类序列，包括例如SEQ ID N0:122所示的序列W及其天然或人工的变体。并且，当描 述皿cAg的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO: 122的序列片段，还包括其天然或人工变体 中的相应序列片段。例如，表述"皿cAg的第79-80位氨基酸残基"包括，SEQ ID NO : 122的 第79-80位氨基酸残基，W及其变体（天然或人工）中的相应片段。根据本发明，表述"相 应序列片段"或"相应片段"是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对W获得最高 百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
[0037] 如本文中所使用的，术语"抗体"是指，通常由两对多肤链（每对具有一条"轻"(L) 链和一条"重"(H)链）组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为K和λ轻链。重链可分 类为μ、δ、丫、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、I曲、IgG、IgA和I姐。在轻 链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的"J"区连接，重链还包含大约3 个或更多个氨基酸的"D"区。各重链由重链可变区（Vh)和重链恒定区（句）组成。重链恒定 区由3个结构域（句1、句2和句3)组成。各轻链由轻链可变区（\)和轻链恒定区（CJ组成。 轻链恒定区由一个结构域C苗且成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包 括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分（Clq)的结合。Vh和 \区还可被细分为具有高变性的区域（称为互补决定区（CDR))，其间散布有较保守的称为 构架区（FR)的区域。各Vh和V油按下列顺序：？1?1、〔01?1^1?2、〔01?2^1?3、〔01?3^1?4从氨基 末端至簇基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区（Vh和V J分别 形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循K油at Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))，或 Chothia & Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 ;Chothia 等人（1989)化Uire 342:878-883的定义。术语"抗体"不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特 别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可W是不同同种型的抗体，例如，IgG(例 如，IgGl，IgG2, IgG3 或 IgG4 亚型），IgAl，IgA2, I曲，I姐或 IgM 抗体。
[003引如本文中所使用的，术语抗体的"抗原结合片段"是指包含全长抗体的片 段的多肤，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗 体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为"抗原结合部分"。通常参见，化ndamental Immunology,化.7 (Paul,W.,ed.,第 2版，Raven Press, N.Y. (1989)，其[^其全文通过引用 合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生 抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括F油、F油'、F(油'）2少(1、。巾、(^6和 互补决定区（CDR)片段、单链抗体（例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体（diabody)和运样的多 肤，其包含足W赋予多肤特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
[003引如本文中所使用的，术语"Fd片段"意指由Vh和CJ结构域组成的抗体片段；术语 "Fv片段"意指由抗体的单臂的V郝V Η结构域组成的抗体片段；术语"dAb片段"意指由V Η 结构域组成的抗体片段（Ward等人，化化re 341:544-546(1989));术语"F油片段"意指由 心VC郝CJ结构域组成的抗体片段；术语叩(油'）2片段"意指包含通过较链区上的二硫 桥连接的两个F油片段的抗体片段。
[0040] 在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体（例如，scFv)，其中\和 Vh结构域通过使其能够产生为单个多肤链的连接体配对形成单价分子（参见，例 如，Bird 等人，Science 242:423-426 (1988)和 Huston 等人，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988))。此类scFv分子可具有一般结构：畑2-\-接头-Vh-COOH或畑z-Vh-接 头-\-C00H。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可 使用具有氨基酸序列（GGGGS)4的接头，但也可使用其变体Ololliger等人（1993)，Proc. 化tl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人（1995)， Protein ling. 8:725-731，Qioi 等人（2001)，Eur.J. Immunol. 31:94-106, Hu 等人（1996)， Cancer Res. 56:3055-3061，Kipriyanov 等人（1999)，J. Mol. Biol. 293:41-56 和 Roovers 等人（2001)，Cancer Immunol.描述。
[0041] 在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中Vh和V L结构 域在单个多肤链上表达，但使用太短的连接体W致不允许在相同链的两个结构域之间配 对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位（参见，例 如，Holliger P.等人，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)，和化Ijak R.J.等 人，StrucUire 2:1121-1123(1994))。
[0042] 可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组DM技术或酶促或化学断裂 法）从给定的抗体（例如本发明提供的单克隆抗体4A2)获得抗体的抗原结合片段（例如， 上述抗体片段），并且W与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合 片段。
[0043] 在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语"抗体"时，其不仅包括完整抗 体，而且包括抗体的抗原结合片段。
[0044] 如本文中所使用的，术语"单抗"和"单克隆抗体"是指，来自一群高度同源的 抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完 全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单 克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，运些不同的抗体通常识 别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得 (化Uire, 256:495, 1975)，但也可采用重组DNA技术获得（如参见U.S.P 4,816,567)。
[0045] 如本文中所使用的，W编号提及的单克隆抗体与从相同编号的杂交瘤细胞株获得 的