的通道的示意图。
[0066]图18b是图13a中示出的第一实施例的替代的布置。
[0067]图19a是根据本发明的第二实施例的在射流卡盘内的通道的示意图。
[0068]图19b是图14a中示出的第二实施例的替代的布置。
[0069]图19c是图14a中示出的第二实施例的另一替代的布置。
[0070]图20a是适合用于本发明的泡罩的截面视图。
[0071]图20b是图15a中示出的泡罩的俯视图。
[0072]图21a是适合用于本发明的阀门的截面视图，其中所述阀门在闭合位置中。
[0073]图21b是图16a的阀门的截面视图，其中所述阀门在打开位置中。
[0074]图22是根据本发明的第三实施例的在射流卡盘内的通道的示意图。
[0075]图23是根据本发明的第四实施例的在射流卡盘内的通道的示意图。
[0076]图24是示出在操作图18a中示出的卡盘的方法中的步骤的流程图。
[0077]图25是示出在操作图19a中示出的卡盘的方法中的步骤的流程图。
【具体实施方式】
[0078]现将在其中实施本发明的示例性射流卡盘的情形下描述本发明的实施例。尽管不必理解本发明，但提供对射流卡盘的结构、制造、功能和用途的原理以及用于执行测试的相关联方法的大体描述是有益的。
[0079]经选择以说明本发明的示例性射流卡盘和相关联方法用于使用PCR扩增和电化学检测来检测沙眼衣原体细菌。然而，技术人员将理解，本发明不限于示例性射流卡盘和相关联方法，且适合用于各种不同的卡盘以用于广泛多种的样本分析技术或生物学测定;例如，在液体样本中的靶核酸序列的测定。
[0080]所属领域的技术人员将理解，本文中所描述且附图中所说明的本发明的装置和方法是非限制性示例性实施例且本发明的范围仅通过权利要求书界定。结合一个示例性实施例所说明或者描述的特征可以与其它实施例的特征组合。此类修改和变化包含在本发明的范围内。
[0081]示例性卡盘包括:射流部分，样本流动通过所述射流部分且其中进行核酸扩增和检测;气动部分，其控制通过射流部分的流；以及至少两个电极，其提供用于所关注的经扩增核酸的检测的电位差。射流部分和气动部分可以由射流层、射流箔片、气动层以及气动箔片构造，例如下文关于示例性卡盘描述的那些射流层、射流箔片、气动层以及气动箔片。然而，射流部分未必仅由射流层和射流箔片构成且气动部分未必仅由气动层和气动箔片构成。确切地说，所述层可以相互作用以产生射流部分和气动部分，使得所述层中的全部或一些的各部分构成每个部分。射流部分是指卡盘的提供允许受控样本流的功能的特定区域，且气动部分是指卡盘的提供控制通过射流部分的流的功能的特定区域，而非指卡盘的特定层。
[0082]外壳、射流部分和气动部分由塑料制成。塑料意指可以在较软时成形且随后被硬化的合成或天然有机材料，包含树脂、树脂状物质、聚合物、纤维素衍生物、酪蛋白材料以及蛋白质塑料。可以构造卡盘的塑料的实例包含但不限于热塑性塑料，例如聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃共聚物(例如黄宝石、丙烯腈丁二烯苯乙烯)；以及热塑性弹性体，例如聚丙烯。塑料外壳、射流部分和气动部分可以包含不由塑料制成的组件(例如，由金属箔制成的泡罩、在样本入口处的金属嵌件)，但所述组件主要由塑料形成。塑料材料的使用促进卡盘的经济制造。
[0083]尽管气动和射流箔片可以由金属箔制成，但优选的材料是塑料，包含上述塑料。具体来说，优选的是，箔片是聚对苯二甲酸乙二酯/聚丙烯复合物。
[0084]靶核酸序列是将在样本中检测到的任何核酸。将在卡盘中被扩增且检测到的靶核酸将通常是DNA，但还可能扩增且检测RNA。在一些实施例中，卡盘可以准许DNA和RNA靶两者的扩增和/或检测。
[0085]液体样本是被引入到卡盘以便确定所关注的靶核酸是否存在的组成。所述样本可以是其中待检测的核酸疑似存在的组成(例如，用于临床诊断)，或可以是其中待检测的核酸有可能存在的组成(例如，用于污染测试)。
[0086]液体样本可以具有各种来源。举例来说，所述液体样本可以是从动物或植物获得的材料(例如，用于感染的诊断或用于基因分型)。此类样本可以在微创或无创的情况下获得，例如，所述样本可以使用拭子从动物获得，或可以是体液。作为替代方案，所述样本可以是从食品或水获得的材料(例如，用于污染测试)。所述样本将通常包含细胞，且靶核酸(如果存在)可以从卡盘内的这些细胞提取。所属领域的技术人员将了解，样本在被引入到卡盘之前可以被稀释或以其它方式进行处理，但优选的是，卡盘可以处理尚未以此方式进行预处理的材料。
[0087]从其获得样本的动物可以是脊椎动物或非脊椎动物。脊椎动物可以是哺乳动物。哺乳动物的实例包含但不限于小鼠、大鼠、猪、狗、猫、兔、灵长类动物或类似者。所述动物可以是灵长类动物，且优选地是人。因此卡盘可以用于人类样本的临床诊断。
[0088]除分析样本之外，卡盘还可以分析阳性和/或阴性对照以提供卡盘如预期一般起作用的确认。对照组可以由使用者引入到卡盘中，或可以在使用之前包含在卡盘内。
[0089]包含内部的阳性对照核酸允许使用者识别是否已经获得样本的阴性结果，因为核酸扩增已经失败(假阴性)。如果尽管阳性对照核酸存在于扩增室中，但在检测室中未能检测出所述核酸，那么使用者将能够将测试识别为可能的假阴性结果，且可以执行另一测试。
[0090]包含内部的阴性对照组允许使用者识别是否已经由于污染的存在错误地获得阳性结果。阴性对照可以包括在没有必需的组分的情况下在其中不提供核酸或其中样本经受扩增反应的腔室中执行PCR，例如没有引物的PCR。如果尽管核酸既定不存在于扩增室中，但仍在检测室中检测到所述核酸，那么使用者将能够将测试识别为可能的假阳性结果，且可以执行另一测试。
[0091]阳性对照核酸可以是将未在用于卡盘中的样本中发现的任何核酸。内部对照DNA可以从细菌获取，所述细菌并不对动物致病且包含高度特定针对所述细菌的核酸。从其可以获取动物样本的对照核酸的可能的细菌的一个实例是黑胫病菌，但可以使用将不存在于样本中的任何对照核酸。
[0092]卡盘的射流部分包括样本流动通过的通道和腔室。通过卡盘的样本流在两种方式被控制。首先，射流部分具有气体入口。所述气体入口连接到气体供应装置，且气体经由此入口注入到射流部分中允许朝向检测室将样本向下游推动通过卡盘。气体供应装置可以由阅读器(reader)提供。作为替代方案，气体供应装置可以是机载气体供应装置。优选地，气体供应装置由外部源提供且气体入口连接到气动回路，使得气体供应装置经由卡盘上的气动入口提供。第二，至少一个气动控制的阀门控制样本通过射流部分的局部移动。所述气动控制的阀门可以独立于其它气动控制的阀门而被控制，且可以独立于大体上导致样本经由气体入口的下游移动的气体供应装置而被控制。气体入口和气动控制的阀门还准许样本冲过射流部分(例如)以排除过量体积的材料。射流部分还具有排气装置，所述排气装置允许空气和废料离开射流部分的通道和腔室而没有压力的积聚出现在卡盘中。优选地，排气装置包括废物室和/或废物出口。
[0093]卡盘的射流部分包含用于细胞裂解和核酸分离的试剂和/或物理组件。这些试剂和/或物理组件可以是能够裂解细胞且使核酸与细胞碎片以及其它细胞组分分离的任何试剂或物理组件。举例来说，它们可以包括(i)裂解缓冲液，其能够导致可能存在于样本中的靶细胞裂解，例如包含壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(可用作NP-40)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(可用作曲通X 100)等清洁剂或包含异硫氰酸胍的缓冲液，和/或(ii)捕获支架或柱，其专门地结合核酸但不结合其它不希望的细胞组分(例如，蛋白质和脂质)。捕获柱包括捕获过滤器且可以另外包括深度过滤器。过滤器可以由玻璃纤维制成(可用作惠特曼过滤器)，或可以由二氧化硅制成，但可以使用能够使核酸与其它细胞组分分离的任何柱或支架。可以进行使用洗涤缓冲液去除细胞碎片和其它细胞组分的洗脱，其后是使用洗脱缓冲液从捕获支架或柱洗脱分离的核酸的洗脱，使得捕获柱可以使核酸与细胞碎片和其它细胞组分分呙。
[0094]样本流动通过的通道将样本入口流体地连接到其中可以进行核酸扩增的至少一个扩增室。扩增室的目的是准许存在于样本中的任何所关注的靶核酸(以及，当存在时，任何阳性对照核酸)的扩增。可以使用任何核酸扩增方法且下文关于示例性卡盘更详细描述这些。所需用于不同核酸扩增方法的不同的核酸扩增试剂是所属领域中众所周知的。这些试剂提供于扩增室中或提供于扩增室的上游，使得样本(和任何阳性对照组)一旦到达扩增室就包含用于核酸扩增的所有必需的试剂。根据待检测靶核酸的核酸扩增方法的调适也是所属领域中众所周知的(例如，引物的设计)。技术人员因此将能够相应地调适用于核酸扩增的试剂。术语“腔室”不指示任何特定的大小或几何结构，而是意指在射流部分内经设计以准许发生核酸扩增的区域。因此，举例来说，所述腔室可以是其中当发生所需用于核酸扩增的步骤(例如，热循环等)时样本可以流体地隔离(例如，经由气动控制的阀门的使用)，且所述腔室可以位于卡盘内，使得其接近所需的任何外部资源(例如，紧邻卡盘阅读器内的热源，由此准许热循环发生)。
[0095]多个测试扩增通道和/或腔室可以包含于卡盘中。不同的测试扩增通道和/或腔室可以包含所需用于扩增所关注的不同核酸的试剂。因此使用多个扩增测试通道和/或腔室允许同时(包含任何控制组)在单一卡盘上执行多个测试。作为替代方案，用于多个不同核酸的扩增的试剂可以存在于单一扩增室中，且不同的核酸(无论是多个靶核酸还是某一靶核酸和对照核酸)可以在相同扩增室中同时扩增。
[0096]样本在核酸扩增之后流动通过的另一通道将至少一个扩增室流体地连接到其中可以检测到核酸扩增的结果的至少一个检测室。在检测室中或在检测室的上游的是用于核酸检测的试剂，使得样本一旦到达检测室就包含用于检测的所有必需的试剂。用于核酸检测的试剂可以对特定靶核酸具有特异性，即，其可以允许检测具体的核酸序列的存在。作为替代方案，用于核酸检测的试剂可以是用于检测任何核酸的存在的通用试剂。如果在检测之前去除了除靶核酸外的所有核酸，那么可以使用此类通用试剂。例如，这可以通过提供能够水解存在于样本中的除靶核外的所有核酸的核酸酶来实现。(例如)通过将化学改质包含在引物中，可以保护经扩增靶核酸免受水解，所述引物并入到经扩增产物中且不能被水解。用于核酸检测的试剂在下文关于示例性卡盘进行描述但通常包括包含标记的探针。所述探针能够与已经在扩增室中扩增的经扩增核酸杂交。在探针与经扩增核酸杂交之后，核酸的检测可以经由来自标记的信号中的可检测变化而进行。在一些实施例中，所述变化可由探针的水解导致。当探针被水解时，水解通常使用双链特异性核酸酶来实现，所述双链特异性核酸酶可以是核酸外切酶或核酸内切酶。优选地，核酸酶是T7核酸内切酶。来自标记的信号能够经受在探针的水解之后的变化。这是由于当标记从结合到探针的其余部分移动到脱离探针的其余部分或结合到单核苷酸或探针的较短部分时在所述标记的环境中的变化导致。可以使用的探头的类型和检测方法的进一步细节可以在希利尔(Hillier)等人在《生物电化学》63(2004)第307到310页上的描述中找到。作为替代方案，可以使用导致来自标记的信号中的可检测变化(其并不依赖于探针的水解)的方法，例如，见伊哈拉(Ihara)等人在《核酸研究》1996年第24卷第21期第4273到4280上描述。标记的环境中的此变化引起来自标记的信号中的变化。可以检测来自标记的信号中的变化以便检测所关注的核酸的存在。
[0097]当使用阳性对照核酸时，用于核酸检测的试剂将另外包含阳性对照探针，所述探针包含标记。阳性对照探针能够与经扩增对照核酸杂交。由阳性对照组的标记提供的信号与靶探针可以相同，但存在于单独的检测室中，使得可以区分与对照组和测试核酸相对应的信号。作为替代方案，由对照组的标记提供的信号与靶探针可以不同，使得即使探针存在于相同的检测室中，信号也可彼此区分。
[0098]多个测试检测通道和/或腔室可以包含于卡盘中。不同的测试检测通道和/或腔室可以包含所需用于检测所关注的不同核酸的试剂。因此，使用多个检测测试通道和/或腔室允许同时在单一卡盘上执行多个测试。作为替代方案，用于多个不同核酸的检测的试剂可以存在于单一检测室中，且不同的核酸(无论是多个靶核酸还是某一靶核酸和对照核酸)可以在相同检测室中同时检测。
[0099]标记可通过使用卡盘的电极来检测，并且因此标记将通常是电化学标记，例如二茂铁。可以使用的标记的实例可以在W003/074731、W02012/085591以及PCT/GB2013/051643中找到。由标记发出的信号可以通过卡盘阅读器检测到。
[0100]卡盘的气动部分包括各自控制至少一个气动控制的阀门的至少一个气动回路。气动部分通过打开和闭合气动控制的阀门来控制通过卡盘的样本流。阀门的打开和闭合通过在气动回路中通过气动压力入口施加的气动压力中的变化控制。通常，卡盘包含许多气动控制的阀门。气动控制的阀门可以通过单独的气动压力入口控制。这些阀门可以用于防止样本向下游移动通过射流部分直到已经执行必需的步骤和/或用于防止样本向上游的不希望的反向移动。例如，阀门可以提供在至少一个扩增室的上游以便防止下游移动到至少一个扩增室中，直到细胞裂解和核酸分离已经发生。在细胞裂解和核酸分离之后，在至少一个扩增室的上游的阀门可以打开以便允许下游流。所述阀门随后可以再次闭合，以防止回流出腔室朝向样本入口返回。
[0101]所述卡盘包括至少两个电极，所述电极可以提供跨越至少一个检测室的电位差。所述电位差使得电流流动通过至少一个检测室，由此准许对来自电化学活性标记的信号的检测。
[0102]现将参考附图描述根据以上描述操作的示例性卡盘。
[0103]1.示例性卡盘
[0104]1.1
[0105]下文描述的示例性卡盘既定为用于对引入到卡盘中的样本执行测试的一次性使用的一次性卡盘。示例性卡盘是具有适当的大小(如下文详述)的通道的射流卡盘。然而，本发明可以在微流体装置或LOC上执行。一旦测试已经运行，优选的是，卡盘就被处理掉。然而，如果需要，卡盘可以被发送用于再处理以使得它能够被再次使用。
[0106]优选的是，卡盘包括用于执行所选的测试所必需的所有生物制剂。例如，示例性卡盘用于检测所关注的病原体的存在、不存在或量。可以检测任何病原体。可以通过卡盘检测的病原体的实例是沙眼衣原体、阴道毛滴虫、淋球菌、生殖支原体以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。为此，卡盘包括用于核酸扩增的试剂。核酸扩增可以使用任何核酸扩增方法执行。核酸扩增方法可以是热循环方法，其中执行所述方法的温度发生变化，使得扩增的不同步骤能够在循环内在不同温度处进行。例如，引物的熔化、退火以及延伸可以各自在不同温度处执行。通过在温度之间循环，可以控制所述方法的步骤中的每一个的时序。作为替代方案，核酸扩增可以是其中温度保持恒定的等温方法。在热循环和等温核酸扩增方法两者中，温度在核酸扩增期间得到控制。
[0107]核酸扩增方法的实例是聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、解旋酶依赖性扩增以及环介导等温扩增。用于核酸扩增的试剂将取决于所使用的核酸扩增方法而改变，但包含聚合酶和核苷酸三磷酸。
[0108]如下文所解释，所述卡盘还包括检测试剂，所述检测试剂能够检测经扩增核酸的存在或不存在，所述经扩增核酸是核酸扩增方法的产物。用于核酸检测的试剂包括能够与经扩增核酸杂交的探针。所述探针包含二茂铁标记。
[0109]在探针与经扩增核酸杂交之后，核酸的检测可以经由来自标记的信号中的可检测变化而进行。所述变化由探针的水解导致，所述水解使用双链特异性核酸酶实现。核酸酶是T7核酸内切酶。二茂铁在其是探针的部分时或在其仅附接到单核苷酸时给出不同的电化学信号，并且因此容易检测到水解。因此，来自标记的信号中的变化准许对所关注的核酸的存在的检测。
[0110]电极允许在来自标记的信号中的可检测变化，所述变化在存在待检测的靶核酸的情况下出现。
[0111]所述卡盘经配置用于与卡盘阅读器(未图示)一起使用。所述卡盘包括多个气动、机械、热和电气接口(下文更详细描述)，阅读器通过所述接口与卡盘交互以执行测试。因此，在使用中，卡盘将插入到阅读器中，且阅读器将被激活以经由接口开始与卡盘交互以执行测试。出于理解本发明的目的，不必精确描述卡盘如何与阅读器交互以执行特定的测试且提供测试结果，但下文提供卡盘的示例性操作的概述。
[0112]1.2示例性卡盘的示意图
[0113]在详细地解释示例性射流卡盘的组件的结构和布置之前，参考图1中示出的示意图描述在高层级处的示例性卡盘的布局是有帮助的。
[0114]就通过卡盘的液体流(包含液体样本)而言考虑卡盘的总布局是方便的。除非下文另外规定，否则包含液体样本和液体缓冲液的液体的通道被称作‘流体路径’，其具有上游端和下游端。除非下文另外规定，‘下游’一般是指液体的流动方向，且‘上游’是指与流动方向相反的方向。示例性卡盘中的流体路径可具有不同分支(且因此形成不同的流体路径)，但所有路径都具有准许技术人员识别上游和下游方向的可辨别流动方向。然而，存在此一般定义的例外，所述例外是当在混合室10和波纹管20之间栗送液体样本时的情况。在此情况下，流体在与其一般的流体流动方向相反的方向上被栗送回上游，所述一般的流体流动方向是下游。此混合用以混合裂解和样本且用以再水化内部对照组。
[0115]液体样本在样本混合室10处通过入口端引入到卡盘中。优选的入口端的特定布置自身可以形成卡盘的隔离的发明性方面，如下文在章节3中进一步描述。样本指示器12流体地耦合到样本混合室10，使得引入到样本混合室10中的样本在样本指示器12中可见。还连接到样本混合室10的是包含裂解缓冲液的泡罩14。裂解缓冲液包括异硫氰酸胍。一旦样本已经引入到样本混合室10中，且测试开始，裂解泡罩14就收缩以便将裂解缓冲液排出到样本混合室1中，其中所述裂解缓冲液与弓I入其中的液体样本混合。
[0116]沿着主要通道16的样本混合室10的下游是粗过滤器18。当液体样本通过主要通道16时，粗过滤器18滤除液体样本中的任何大碎片，例如皮肤或体毛。
[0117]沿着主要通道16的粗过滤器18的下游是波纹管20，其具有上游波纹管阀22a和下游波纹管阀22b。如下文更详细地描述，波纹管20与上游和下游阀门22a到b—起能够将液体样本从流体路径的上游端(即，从样本混合室1)栗送到下游端。总体而言，这借助波纹管20内的柔性膜和上游和下游波纹管阀22a到b实现，所述柔性膜和波纹管阀致动以产生局部压差以一方面将液体样本从样本混合室10吸入到波纹管20中，且另一方面通过主要通道16将液体样本从波纹管20进一步吸到下游。这通过阀门中的柔性膜的仔细地精心设计的气动致动实现。优选的阀门的特定布置自身可以形成卡盘的隔离的发明性方面，如下文在章节3中进一步描述。
[0118]沿着主要通道16的波纹管的下游是捕获柱24。捕获柱24的目的是使核酸与细胞碎片和其它细胞组分分离。捕获柱包括皆由玻璃纤维制成的捕获过滤器和深度过滤器。优选的捕获柱的特定布置自身可以形成卡盘的隔离的发明性方面，如下文在章节3中进一步描述。
[0119]两个分支通道26、28接合在下游波纹管阀22b与捕获柱24之间的主要通道16。分支通道的目的是引入用于执行所希望的测试所必需的液体缓冲液。例如，在通过示例性卡盘执行测试的情况下，一旦样本已经通过，就有必要将洗脱缓冲液和洗涤缓冲液引入到主要通道中。洗涤缓冲液包含于洗涤缓冲液泡罩30中且洗脱缓冲液包含于洗脱缓冲液泡罩32中。将洗涤缓冲液和洗脱缓冲液引入到主要通道16中对应地通过洗涤缓冲液阀门34和洗脱缓冲液阀门36控制。在测试中的适当的点处，洗涤和洗脱缓冲液泡罩30、32收缩以便将洗涤和洗脱缓冲液排出到分支通道26、28中且由此通过洗涤和洗脱缓冲液阀门34、36排出到主要通道16中。
[0120]沿着主要通道16的废物分支16a的捕获柱24的下游是废物室38。优选的废物室的特定布置自身可以形成卡盘的隔离的发明性方面，如下文在章节3中进一步描述。废物室38的目的是收集除核酸外的细胞碎片和细胞组分且容纳它们，由此防止它们进入测试通道54a或对照通道54b。废物室38通过废物出口 40排放到大气中，且在废物室38和废物出口 4