物或联合体，其特征在于在医学治疗中使用。
[0030]本发明的又一个方面涉及治疗或预防由淀粉样蛋白沉积或积累引起或促成的疾病的方法，特征在于包括给予患者治疗有效量的一种或多种拟胰岛淀粉样多肽化合物，特别是人胰岛淀粉样多肽，与聚乙二醇的生物缀合物。
实施例
[0031]下列实施例涉及本发明具体的实施方案，并且不意在以任何方式限制所附权利要求的范围。
[0032]1.本发明缀合物的制备
5 mg/mL人胰岛淀粉样多肽溶液在10 mM PBS (磷酸盐缓冲溶液)pH 7.4存在下与摩尔过量的5 mPEG / I人胰岛淀粉样多肽于25°C反应2h。
[0033]通过加入等量30 %乙腈/0.1 %三氟乙酸(水中)淬灭反应，然后在C18 Kromasil反相柱中以4 mL/min进行色谱分析，检测器设置在220 nm。(Kromasil为瑞典AkzoNobel公司的一个部门，Separat1n Products组出售的产品线)。该纯化过程在图1中示出。色谱图显示在12分钟时单聚乙二醇化胰岛淀粉样多肽的峰。
[0034]进行基质辅助激光解吸和离子化飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)表征单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽。图2显示在9 Kda的单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽的峰。
[0035]2.人胰岛淀粉样多肽和单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽的受体结合测定
测定纯化的单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽对RAMP2和RAMP3共受体的结合相互作用。
[0036]用荧光素异硫氰酸酯在PBS(胎牛血清)pH 7.4中于4°C标记RAMP (受体活性修饰蛋白)lh，并使用相同的缓冲液通过在Sepharose G25 (基于琼脂糖的色谱介质，美国公司GE Healthcare提供)中尺寸排阻色谱(SEC)纯化。标记通过A280和A490处的UV吸光度测量证实，这允许根据约0.5荧光素/RAMP分子估算偶联效率。结合通过测量作为游离鼠胰岛淀粉样多肽、聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽的函数的RAMP-FITC (荧光素异硫氰酸酯)荧光各向异性和通过使用不相关的鸡蛋白溶菌酶(HEWL)作为非特异性结合的对照进行。
[0037]根据图3和图4，结合测定显示在二重测定中(单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽C#1、C#2以及游离胰岛淀粉样多肽# I和#2 )，游离的和纯化的单聚乙二醇化的人胰岛淀粉样多肽二者对共受体RAMP2和RAMP3相似表观的结合亲和性，表明PEG部分不干扰共受体亲和性。使用HEWL的对照测定显示对共受体的非特异性结合。
[0038]3.聚乙二醇化对人胰岛淀粉样多肽聚集分布型的作用
将实施例1的纯化的单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽重悬在DMSO中，稀释到PBS pH7.4中，并且使其在37°C孵育。通过使用淀粉样蛋白显色探针硫黄素T(ThT)针对淀粉样蛋白聚集物评估样品。
[0039]图5显示结果。游离人胰岛淀粉样多肽聚集非常迅速。在3天中，几乎所有的游离人胰岛淀粉样多肽以淀粉样蛋白形式聚集。单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽在第7天仍未显示聚集迹象。该测定证明聚乙二醇化过程能够抑制人胰岛淀粉样多肽的凝聚。
[0040]4.聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽产品的药代动力学
单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽产品的药代动力学在瑞士小鼠体内表征。小鼠在控制温度的房间中以12h的光-暗周期饲养。水和食物可自由取得。形成两组，对照(游离人胰岛淀粉样多肽，非聚乙二醇化)和聚乙二醇化胰岛淀粉样多肽。动物接受100 yL包含10 yg人胰岛淀粉样多肽肽(游离人胰岛淀粉样多肽或纯化的单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽)的盐水。从小鼠后眼窝(retro-orbitally)采集血液(每个时间间隔n=3只小鼠)，并让该血浆接受如制造商(Millipore，Cat Number EZHA-52K - http://www.millipore.com/catalogue/item/ezha_52k)所提供的针对人胰岛淀粉样多肽的ELISA测定。
[0041]图6显示游离胰岛淀粉样多肽的快速血浆衰变，而单聚乙二醇化人胰岛淀粉样多肽在血浆中显示较长的稳定性持续时间。该测定证明人胰岛淀粉样多肽聚乙二醇化过程能够增加其半衰期。
[0042]本领域技术人员可使用本说明书和本文所给实施例的教导在同等的实施方案中实施本发明，这些同等的实施方案虽然没有清楚地描述，但实施相同或相似的功能以获得相同或相似的结果，因此包含在所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1.一种拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，特征在于在医学治疗中使用。2.权利要求1的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，特征在于具有式I (Rl-C0X)m-R2 其中Rl代表甲氧基聚乙二醇(mPEG)部分和具有各种平均摩尔质量的官能间隔基， R2代表胰岛淀粉样多肽或拟胰岛淀粉样多肽化合物， X代表NH或O， m代表与拟胰岛淀粉样多肽化合物(R2)缀合的mPEG聚合物(Rl)单元的数目，所述与拟胰岛淀粉样多肽化合物(R2)缀合的mPEG聚合物(Rl)由mPEG-琥珀酰亚胺基与拟胰岛淀粉样多肽化合物，通过伯胺或羟基官能部分反应经由酰胺键或酯键缀合获得，所述拟胰岛淀粉样多肽化合物包括缺乏Lysl的拟胰岛淀粉样多肽(去-Lysl);或式II的化合物 (RlX)m-R2 其中 Rl代表甲氧基聚乙二醇(mPEG)部分和具有各种平均摩尔质量的官能间隔基， R2代表胰岛淀粉样多肽或拟胰岛淀粉样多肽化合物， X代表NH或O， m代表从mPEG-醛与拟胰岛淀粉样多肽化合物缀合获得的与拟胰岛淀粉样多肽化合物(R2)缀合的mPEG聚合物(Rl)单元的数目。3.权利要求1或2中任一项的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽化合物为天然或合成的人胰岛淀粉样多肽这一事实。4.权利要求1或2中任一项的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽化合物呈其盐、同分异构体、水合物、溶剂合物、前药、代谢产物、同质多象变体或电子等排体形式这一事实。5.拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽化合物为人胰岛淀粉样多肽和包含所述生物缀合物的药学产品、药剂、组合物和联合体为用于在医学治疗中使用这一事实。6.用于在由淀粉样蛋白沉积或积累引起或促成的疾病和功能障碍的预防或治疗中使用的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物。7.权利要求6的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，特征在于所述疾病或功能障碍为高血糖症、糖尿病、低葡萄糖耐受或葡萄糖代谢缺陷、肥胖、代谢综合征、饮食失调、动脉粥样硬化、心肌梗死、中风、冠心病、一般性心脏病、阿尔兹海默病中的一种或多种这一事实。8.权利要求6的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，特征在于用于糖尿病的预防或治疗。9.用于在可用于治疗或预防由淀粉样蛋白沉积或积累所引起或促成的疾病的低毒性产品的制备中使用的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物。10.权利要求9的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，其特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽剂为天然或合成的人胰岛淀粉样多肽这一事实。11.权利要求9的拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，其特征在于所述生物缀合物如权利要求2中所描述这一事实。12.低毒性药物组合物，特征在于它们包含治疗有效量的一种或多种拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的一种或多种非-凝聚生物缀合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂这一事实。13.权利要求12的组合物，其特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽化合物为天然或合成的人胰岛淀粉样多肽这一事实。14.权利要求12的组合物，其特征在于所述生物缀合物如权利要求2中所描述这一事实。15.权利要求12-14中任一项的组合物，其特征在于额外包含一种或多种与拟胰岛淀粉样多肽化合物不同的活性要素。16.权利要求12-14中任一项的组合物，其特征在于额外包含一种或多种与拟胰岛淀粉样多肽化合物不同的选自以下的活性要素:胰岛素、离子例如锌或钠、抗糖尿病药、抗生素、抗高血压药、抗逆转录病毒药。17.用于预防或治疗疾病的佐剂，其特征在于包含拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物。18.权利要求17的用于预防或治疗疾病的佐剂，其特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽化合物为天然的、合成的或生物-半合成的人胰岛淀粉样多肽这一事实。19.权利要求17的用于预防或治疗疾病的佐剂，其特征在于所述生物缀合物如权利要求2中所描述这一事实。20.药剂，特征在于其包含治疗有效量的一种或多种拟胰岛淀粉样多肽剂与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物这一事实。21.权利要求20的药剂，其特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽化合物为天然或合成的人胰岛淀粉样多肽这一事实。22.权利要求20的药剂，其特征在于所述生物缀合物如权利要求2中所描述这一事实。23.治疗或预防疾病的方法，其特征在于包括给予患者治疗有效量的一种或多种拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的非-凝聚生物缀合物，所述疾病由淀粉样蛋白沉积或积累引起或促成。24.权利要求23的方法，其特征在于所述拟胰岛淀粉样多肽化合物为天然或合成的人胰岛淀粉样多肽这一事实。25.权利要求23的方法，其特征在于所述非-凝聚生物缀合物如权利要求2中所述这一事实。
【专利摘要】本发明一般地涉及拟胰岛淀粉样多肽化合物与聚乙二醇的新型非-凝聚生物缀合物及其主要在与胞外淀粉样蛋白沉积或积累有关的疾病的治疗中的用途，所述疾病促成全身性器官例如胰腺功能障碍或衰竭。
【IPC分类】C07K1/113, A61P5/48, A61P9/10, A61K38/22, C07K14/575, A61P3/10, A61K47/48, A61P25/28, A61P5/50
【公开号】CN105658234
【申请号】
【发明人】L.M.特拉姆拜奥里达罗查伊里马, L.H.古尔雷罗罗萨多, M.F.d.阿维拉内特托古特雷斯, B.梅洛维伊拉冈卡维斯费雷拉
【申请人】里约热内卢联邦大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年6月13日