使用携带药物的、双特异性配体靶向的微细胞和干扰素-γ的联合肿瘤治疗的利记博彩app
【专利说明】使用携带药物的、双特异性配体靶向的微细胞和干扰素-γ的 联合肿瘤治疗
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月4日提交的美国临时专利申请号61/887,258的优先权。那 个申请的内容通过引用以其全部并入本文。
【背景技术】
[0003] 当前，用于治疗癌症的大多数药物是全身性施用的。虽然全身性递送细胞毒素抗 癌药物在癌症疗法中起关键作用，但是其还造成严重的问题。例如，将正常组织/器官全身 性地暴露于施用的药物可以引起严重的毒性。这由于以下事实恶化:全身性地递送的癌症 化疗药物经常必须以非常高的剂量递送以克服药物的差的生物利用度和患者内的大体积 分布。同样，全身性药物施用可以是侵入性的，因为其经常需要在大血管中使用固定导管 (secured catheter)。因为全身性药物施用经常需要使用静脉--外周或中枢静脉，其可 以引起局部并发症比如静脉炎。药物的外渗还可以导致在施用的局部部位处的起疱/组织 损伤，比如其在施用长春花生物碱和蒽环类抗生素时是常见的。
[0004] 癌症治疗中的另一个挑战是肿瘤细胞逃避免疫监督。免疫系统和恶性细胞之间的 相互作用在肿瘤发生中起重要作用。免疫系统监测和排斥转化细胞的失败可能导致癌症发 展。肿瘤使用多种机制以逃避免疫介导的排斥。现在，这些机制中的许多在细胞和分子水平 上是已知的。尽管有这种知识，癌症免疫疗法在临床上仍不是完善的疗法。
【发明内容】
[0005] 本发明人发现当动物正在遭受伴发性病毒感染时，经历使用携带抗肿瘤药物的、 双特异性抗体靶向的微细胞的癌症治疗的动物表现出对药物的更大的抗肿瘤应答。进一步 的研究揭示了此背景下观察到的抗癌药物的疗效的增强起因于施用的携带药物的、双特异 性抗体祀向的微细胞的肿瘤杀伤力（tumor-killing capability)和针对肿瘤细胞的激活 的宿主免疫应答之间的协同作用，其自身是由于病毒感染引发的干扰素-γ (IFN-gamma或 IFNy )的增加的表达。
[0006] 已经在单一疗法和与其它抗肿瘤剂联合的情况下研究了 IFN-γ自身的潜在抗肿 瘤用途。然而，这样的研究没有导致临床成功。例如，IFN-α和IFN-γ的联合治疗没有比单独 使用IFN-α的治疗表现出改进。参见，例如，Kloke等，Eur.J.Haematol.48:93-8(1992WP Wandl等，Semin .Oncol .19:88-94( 1992)。经美国食品和药物管理局（FDA)批准的仅有的 IFN- γ适应症是用于治疗慢性肉芽肿性疾病(CGD)和严重的恶性骨硬化症(骨病）。
[0007] 因此，在其一个方面，本公开内容提供了用于治疗对象中肿瘤的方法。该方法需要 向对象施用(A)第一组合物，其包括多个细菌衍生的完好的微细胞和/或死细菌细胞，其微 细胞和死细胞中的每个包含抗肿瘤剂，并且经由附连至微细胞表面的配体靶向至肿瘤细胞 表面受体;和(B)第二组合物，其包括IFN-γ或增加对象中的IFN-γ的表达或活性的药剂。
[0008] 在一些方面，第二组合物包括IFN- γ蛋白，特别是药学上适当纯化的IFN- γ蛋白。 在一些方面，第二组合物包括病毒疫苗。在一些方面，第二组合物包括编码IFN- γ的核酸。
[0009] 在一些方面，第一组合物包括大约IO9至大约101()个微细胞或死细菌细胞。
[0010] 在一些方面，抗肿瘤剂是放射性核素。在一些方面，抗肿瘤剂是化疗药物。在一些 方面，抗肿瘤剂是功能核酸或编码功能核酸的多核苷酸。在一些方面，功能核酸抑制促进肿 瘤细胞增殖、血管生成或化疗抗性的基因和/或抑制细胞凋亡或细胞周期停滞的基因。在一 些方面，功能核酸选自siRNA、miRNA、shRNA、I incRNA、反义RNA或核酶。
[0011] 还提供了包括第一组合物和第二组合物的包装、产品或试剂盒，所述第一组合物 包括多个细菌衍生的完好的微细胞或完好的死细菌细胞，其每个包含抗肿瘤剂并在表面上 携带配体，其中配体具有对非吞噬性哺乳动物细胞表面受体的特异性，并且所述第二组合 物包括干扰素-γ (IFN- γ )或增加对象中的IFN- γ的表达的药剂。
[0012] 在另一个实施方式中，提供了组合物，其包括(a)多个细菌衍生的完好的微细胞或 完好的死细菌细胞，其每个包含抗肿瘤剂并在表面上携带配体，其中配体具有对非吞噬性 哺乳动物细胞表面受体的特异性;和(b) IFN- γ或增加对象中的IFN- γ的表达的药剂。
[0013] 其它目标、特征和优点根据下列描述是显而易见的。给出详细描述和具体实例仅 供说明，因为在【具体实施方式】的精神和范围内的多种改变和修改根据本说明书是显而易见 的。
【附图说明】
[0014] 图1A-1C分别展示了在不同时间点（X轴，显示为剂量数量)处测量的三只狗Α、Β和C 的肿瘤体积(左边的y轴)和血清IFN-γ浓度(右边的y轴）的图表。这些图表显示了当IFN-γ 的血清浓度升高时肿瘤对药物的应答更大。
[0015] 图2图解了使用IFN-γ和双特异性配体靶向的且包裹亚德里亚霉素的完好的微细 胞，联合治疗在具有大约285mm3的肿瘤尺寸的6周龄的雌性无胸腺的裸鼠中建立的人腺泡 状腺癌肿瘤异种移植物的效果。第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠只接受IFN-γ，第3组小鼠 接受 EGFR微细胞Dm并且第4组小鼠接受EGFR微细胞Dtix和IFN-γ。在此实例和接下来的那些中， X轴下方的三角形表示给药时间。
[0016] 图3描绘了使用IFN-γ和双特异性配体靶向的且包裹亚德里亚霉素的、完好的微 细胞，联合治疗在具有大约145mm3的中等肿瘤尺寸的6周龄的雌性无胸腺的裸鼠中建立的 人乳腺肿瘤异种移植物的效果。第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠只接受IFN-γ，第3组小鼠 接受·微细胞I，并且第4组小鼠接受 E微细胞Dc*和IFN- γ。
[0017] 图4图解了使用IFN-γ和双特异性配体靶向的且包裹亚德里亚霉素的完好的微细 胞，联合治疗在具有大约250mm3的大肿瘤尺寸的6周龄的雌性无胸腺的裸鼠中建立的人乳 腺肿瘤异种移植物的效果。第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠只接受IFN-γ，第3组小鼠接 受·微细胞 D〇x，并且第4组小鼠接受E微细胞Dc*和IFN- γ。
[0018] 图5描绘了使用IFN-γ和双特异性配体靶向的且包裹亚德里亚霉素的完好的微细 胞，联合治疗在具有大约265_3和大约600_ 3之间的超大肿瘤尺寸的6周龄的雌性无胸腺的 裸鼠中建立的人乳腺肿瘤异种移植物的效果。全部四只小鼠接受EeFR微细胞Dc 1JPIFN- γ。
[0019] 图6描绘了使用IFN-γ (两种不同的剂量)和双特异性配体靶向的且包裹亚德里亚 霉素的完好的微细胞，联合治疗在具有大约IOOmm3的肿瘤尺寸的6周龄的雌性无胸腺的裸 鼠中建立的人腺泡状腺癌肿瘤异种移植物的效果。第1组小鼠接受盐水，第2组小鼠接受EeFR 微细胞Dc*，第3组小鼠每周两次接受EGFR微细胞此\和0.75 X IO4IU的IFN- γ，并且第4组小鼠每 周三次接受EGFR微细胞Dcix和0.5 X IO4IU的IFN- γ。
[0020] 图7图解了人受体酪氨酸激酶的20个亚家族和58个成员（摘录自Lemmon和 Schlessinger,Cell 141：1117-134(2010))〇
【具体实施方式】
[0021] 如上所述，本发明人确定在其中患者暴露于升高水平的INF-γ的情况下，向患有 肿瘤的患者施用携带抗肿瘤药物的、双特异性抗体靶向的微细胞导致抗肿瘤应答与当IFN-γ未激活时一一例如，当其水平低于检测极限时一一所观察到的相比极大地改进。微细胞 介导的抗肿瘤活性和升高的IFN-γ之间的此协同作用根据增加的肿瘤应答的程度是显而 易见的。不承诺为任何具体的机制（一种或多种），本发明人预期本文描述的方法利用了在 宿主抗肿瘤应答中重要的免疫刺激中的关键的途径。细菌衍生的微细胞和IFN- γ在免疫刺 激中引起不同的途径，其在增大抗肿瘤应答中共同地重要，所述抗肿瘤应答在抗肿瘤药物 经由根据本公开内容的双特异性抗体靶向的微细胞被细胞内递送至肿瘤细胞后起始。
[0022] 本发明人还发现围绕肿瘤细胞的血管呈现出完整性的损失；即，脉管具有大的穿 孔并且是"漏的"，甚至在血脑屏障(BBB)环境中。违反常规的理解，因此，与微细胞一样大的 微粒，即，比上面讨论的BBB的一致孔径限制大的多，却比漏的血管的壁中的穿孔小；因此， 它们可通过这些穿孔被动地外渗并且进入肿瘤微环境。
[0023] 一旦进入肿瘤微环境，微细胞能够通过宿主肿瘤细胞引发受体介导的内化，并且 被它们取出。因而，包裹有抗肿瘤剂的微细胞将释放药剂进入肿瘤细胞的细胞质，将其杀 死。
[0024] 虽然已经建议将IFN-γ用于肿瘤治疗，但是很大程度上由于其高毒性，其临床应 用迄今为止都很有限。IFN-γ刺激对肿瘤细胞的免疫应答的能力还未见非常成功。因此，在 本发明的背景下，IFN-γ所起的作用不仅是有利的，而且是真正地意想不到的。
[0025] 因此，在其方面的一个中，本公开内容提供了用于肿瘤的疗法，其需要向患有肿瘤 的患者施用由携带抗肿瘤剂的多个完好的、细菌衍生的微细胞组成的组合物，同时还向患 者施用增加他或她的IFN-γ水平的药剂。根据另一个方面，死细菌细胞可以与微细胞一起 使用或代替微细胞，因为这样的细胞同样可以携带抗癌药物，所述抗癌药物在摄入靶肿瘤 细胞时释放。参见，例如，公布的国际申请W0/2008/012695，其内容通过引用并入本文。
[0026] 含有携带药物的微细胞和/或死细菌细胞的组合物的施用优选地是全身性的，例 如，静脉内的或动脉内的。进一步，IFN-γ或诱导IFN-γ的表达的药剂可以通过不同的途径 施用，即，皮下的或肌肉内的。可以伴随IFN-γ或在不同时间时施用微细胞和/或死细菌细 胞治疗剂。
[0027] (A)定义
[0028] 除非另外规定，用于本说明书的所有技术和科学术语具有与相关领域的技术人员 一般所理解的相同的含义。
[0029] 为了方便，下面提供了在说明书、实施例和所附的权利要求中采用的某些术语和 短语的含义。整个说明书定义了其它术语和短语。
[0030]单数形式"一个(a)"、"一个(an)"和"该(the)"包括复数指代，除非本文另外明确 地规定。
[0031 ] 在本文可交换地使用的"癌症(cancer)"、"瘤(neoplasm)"、"肿瘤(tumor)"、"恶性 肿瘤(malignancy)"和"癌(carcinoma)"是指表现出异常生长表型的细胞或组织，其特征在 于细胞增殖控制的显著丧失。本公开内容的方法和组合物特别适用于恶性、预转移性、转移 性和非转移性细胞。
[0032] "药物"是指在动物中，特别是在哺乳动物和人中产生局部或全身性效果的任何生 理学或药理学活性物质。
[0033] 在本说明书中可交换地使用的术语"个体"、"对象"、"宿主"和"患者"是指期望对 其诊断、处理或治疗的任何哺乳动物对象。个体、对象、宿主或患者可以是人或非人动物。因 而，合适的对象可以包括但不限于非人灵长类、牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠和小鼠。
[0034] 术语"治疗（treatment、treating、treat)"等是指在肿瘤患者中获得期望的药理 学和/或生理学效果。效果在完全地或部分地防止肿瘤或其症状方面可以是预防性的，和/ 或在部分或完全稳定化或治愈肿瘤和/或归因于肿瘤的不利效果方面可以是治疗性的。治 疗涵盖哺乳动物中，特别是人中的肿瘤的任何治疗。特别地，期望的效果是肿瘤应答，其可 以测量为肿瘤质量的减少或肿瘤质量增加的抑制。除肿瘤应答以外，总存活率、无进展存活 率或肿瘤复发时间的增加，或者不利效果的减少也可以在临床上用作期望的治疗效果。
[0035] (B)治疗
[0036]本公开内容通过实验证据来反映和证实，与本发明人的发现一致，细菌衍生的且 完好的微细胞或完好的死细菌细胞，当连同增加 IFN-γ的水平的药剂一起施用至肿瘤患者 时，可以实现比当单独地施用微细胞或死细菌细胞时更出人意料地大的疗效。
[0037] (C)抗肿瘤剂
[0038] 术语"抗肿瘤剂"表示预防或抑制瘤细胞的生长、发育、成熟或扩散的化学或生物 药物。
[0039] 在本公开内容的背景下，选择用于治疗给定的肿瘤患者的抗肿瘤剂取决于多个因 素，其与常规的医疗实践一致。这些因素包括但不限于患者的年龄、肿瘤的阶段、和患者已 经接受的任何先前治疗。
[0040] 根据本公开内容，药物可以选自下面详述的类别中的一个，用于包裹进入完好的、 细菌衍生的微细胞，其然后被施用以治疗肿瘤。这些药物还可以是根据药物设计和发现工 作设计的合成类似物。
[0041] ?多官能烷化剂，例举环磷酰胺(环磷氮芥）、氮芥、苯丙氨酸氮芥(美法兰）、瘤可 宁(苯丁酸氮芥）、噻替派(Thiopeta(Thioplex))、白消安(马利兰）。
[0042] ?烷化药物，例举甲基苄肼（丙卡巴肼）、达卡巴嗪（DTIC)、六甲蜜胺（克瘤灵 (Hexalen))、苯丁酸氮芥(Clorambuci 1)、顺钼(氯氨钼）、卡钼、异环磷酰胺（Ifosafamide)、 奥沙利铂。
[0043] ?抗代谢物，例举氨甲蝶呤(MTX)、6-硫嘌呤(Thiopurines (巯基嘌呤[6-MP]、硫鸟 噪呤[6-TG]))、疏基噪呤(Purinethol )、硫鸟噪呤、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨：（克拉立平 (Leustatin))、喷司他丁、氟尿啼啶(5-FU)、阿糖胞苷(ara-C)、阿扎胞苷。
[0044] ?植物碱、萜类和拓扑异构酶抑制剂，例举长春花碱(长春碱）、长春新碱(长春灭 瘟碱）、长春碱酰胺、长春瑞滨、鬼臼脂素（依托泊甙{VP-16}和替尼泊甙{VM-26})、喜树碱 (托泊特坎和伊立替康）、紫杉烷比如紫杉醇（紫杉酚）和多烯紫杉醇(DocetaxeK泰素替 尔)）。
[0045] ?抗生素，例举亚德里亚霉素(阿霉素、Rubex、阿霉素脂质体(Doxil))、柔红霉素、 多卡霉素(Duocarmycin)、伊达比星、放线菌素D(更生霉素）、普卡霉素(光辉霉素）、丝裂霉 素:（丝裂霉素C)、博莱霉素(硫酸博莱霉素）。
[0046] ?激素剂，例举雌性激素和雄性激素抑制剂(他莫昔芬和氟他胺）、促性腺激素释 放激素激动剂（亮丙瑞林和戈舍瑞林（促效药））、芳香酶抑制剂（氨鲁米特和阿那曲唑 (Anastrozole(瑞宁得(Arimidex)))) ·
[0047] ?各种抗癌药物，例举安吖啶、天冬氨酰酶（左旋门冬酰胺酶）、羟基脲、米托蒽醌 (诺安托(Novantrone))、米托坦(解腺瘤(Lysodren))、美登素(Maytansinoid)、视黄酸衍生 物、骨髓生长因子(沙格司亭和非格司亭）、氨磷汀。
[0048] ?干扰叶酸代谢的药剂，例如，培美曲塞(Pemetrexed)。
[0049] · DNA低甲基化药剂，例如，阿扎胞苷、地西他滨。
[0050] ?聚（二磷酸腺甙[ADP ]-核糖）聚合酶(PARP)途径抑制剂，比如I n i par i b、奥拉帕 尼(Olaparib)、维利帕尼(Veliparib)。
[0051] · PI3K/Akt/mT0R途径抑制剂，例如，依维莫司(Everolimus)。
[0052] ?组蛋白脱乙酰基酶（HDAC)抑制剂，例如，伏立诺他（Vor inostat )、恩替诺特 (Entinostat(SNDX_275))、莫替司他（Mocetinostat(MGCD0103))、帕比司他（Panobinostat (LBH589))、罗咪酯肽(Romidepsin)、丙戊酸。
[0053] ?细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，例如，夫拉平度(Flavopiridol)、奥罗 莫星（Olomoucine)、Roscovitine、Kenpaullone、AG_024322(辉瑞）、海洋活性生物喊 (Fascaplysin)、Ryuvidine、Purvalanol A、NU2058、BML-259、SU9516、PD-0332991、P27