结合人类补体c5的稳定多肽的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及结合人类补体组分5(C5)的多肽，以及所述多肽在治疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 补体蛋白C5是补体系统的主要成分;先天免疫系统的关键部分。补体系统是一个 复杂免疫监测系统，其具有受到严格控制、在多种过程中的许多任务。它作为抵御其他生物 感染的第一道宿主防御系统起作用，并且也将健康的宿主组织与细胞碎片、凋亡的和坏死 的细胞区别开。此外，它参与了清除免疫复合体、调节适应性免疫反应、促进组织再生、血管 生成、干细胞动员和中枢神经系统的发育(woodruff等Mol Immunol 2011，48( 14) :1631-1642;Ricklin等Nat Immunol 2010,11(9) :785-795)。扰乱补体激活和调节的精细平衡的 任何触发，例如错误的或无限制地激活或不足的调节，可能导致包括自我攻击宿主细胞导 致大量组织损伤的病态状况。
[0003] 补体系统由30种蛋白质组成。存在三种启动补体的途径:经典途径使用Clq识别细 胞表面的免疫复合体；当甘露醇结合凝集素(MBL)识别某些糖时，启动凝集素途径;和由补 体因子3(C3)水解自发启动的备用途径，该过程受到在入侵病原体上不存在的某些哺乳动 物细胞表面分子的抑制。这条备用途径也作为补体系统的放大环路。所有三条途径汇聚于 C3级别。C3裂解成C3a和C3b导致形成转化酶，这种转化酶转而裂解补体因子5(C5)成C5a和 C5b<X5是各种免疫细胞的非常有效的引诱剂，而C5b与C6-9寡聚体化形成被称为膜攻击复 合体(MAC)或有时末端补体复合体(TTC)的孔。补体系统激活导致许多机制，目的是中和病 原体;在细胞诸如入侵细菌表面形成MAC导致溶解，沉积C3和C4裂解产物C3b和C4b有助于调 理素作用，导致由巨噬细胞吞噬病原体的作用和过敏毒素诸如C3a和C5a吸引单核细胞和中 性粒细胞到激活的位点，上调表面标志物，导致增强的免疫敏感性和细胞因子的释放。
[0004] C5是190-kDa的糖蛋白，包含两个二硫键连接的多肽链α和β，其分子质量分别是 115和75kDa(Tack等Biochem 1979，18:1490-1497)。他￥11&11(1 等（J Immun 1991,146:362-368)构建人类补体pr〇-C5的完整的cDNA序列，所述cDNA序列被预测编码一个1676个氨基酸 的前体分子，这个前体分子包含18个氨基酸的前导肽和分开0和<1链的4个氨基酸接头(SEQ ID NO: 251)。由于C5为所有补体激活途径共有，不论刺激为何，阻断C5将终止级联反应的进 程，从而防止末端补体激活的有害的性质，同时使邻近的补体级联的免疫保护和免疫调节 功能保持原样。
[0005] 补体系统在抵御病原菌中的总体关键作用使其成为用于药物学介入的令人关注 的目标。补体的许多突变或受损的调节参与各种疾病和状况的事实强调了这点。这些包括 对自身免疫性疾病诸如系统红斑狼疮(SLE)增强的易感性，其中免疫复合体沉积引发经典 途径(Manderson等Annu Rev Immunol 2004,22:431_456)。此外，补体蛋白C1-C5的突变常 常导致SLE或类似SLE的症状。补体系统强烈参与的其他自身免疫性疾病是风湿性关节炎 (RA )，其中免疫复合体可能激活在RA关节处的补体、Sj 0gren氏综合征、皮肌炎、和其他自身 抗体驱动的疾病诸如Gui Ilain-Barrg综合征(GBS)、Fisher综合征(Kaida等J .Neuroimmun 2010，223:5-12)、不同类型的血管炎、系统性硬化病、抗小球的基膜(anti-GBM)和抗磷脂综 合征（APS)(Chen等J Autoimmun 2010,34:J276_J286)。而且，在诸如牙周炎（Abe等J Immunol 2012，189:5442-5448)、伤 口愈合（Cazender等Clin Dev Immunol 2012,在线出 版）、肿瘤生长(Markiewski等Nat Immunol 2008,9:1225-1235)和眼部疾病(诸如葡萄膜炎 和年龄相关的黄斑变性(AMD)) (Copland等Clin Exp Tmmunol 2009，159:303-314)的不同 状况的动物模型中，补体抑制已经被证明有效。
[0006] 靶向人类补体C5的抗体从例如，WO 95/29697、W0 02/30985和WO 2004/007553可 知。依库丽单抗(Soliris?)是一种针对蛋白C5的人源化的单克隆抗体并且防止C5裂解成 C5a和C5b。依库丽单抗已经显示出在治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)中是有效的，并 且被批准用于这种适应症，PNH是一种罕见的并且有时危及生命的以血管内溶血性贫血、血 栓形成倾向和骨髓衰竭为特征的血液疾病。依库丽单抗最近也被Π)Α批准用于治疗非典型 的溶血综合征(aHUS)，一种由于备用补体途径失控导致过度激活引起的罕见但危及生命的 疾病，表现为:血栓性微血管病(TMA)，导致损害生命器官诸如肾脏、心脏和脑的持续危险。 在aHUS中，移植受损的器官只能暂时地帮助患者，因为肝脏继续产生控制蛋白（通常是补体 因子H或备用途径的其他蛋白）的突变形式。短暂的急性的病理生理的相关疾病是由通过感 染志贺毒素阳性大肠杆菌（STEC-HUS)导致的HUS，并且也存在对这一病症暗示药效的有希 望的临床数据(Lapeyraque等N Engl J Med 2011,364:2561-2563)。最后，C5阻断抗体依库 丽单抗已经证明在高度不匹配的肾脏接受者中防止抗体介导的排斥（AMR)是有效的 (Stegall，M.D.等 Am J Transplant 2011,11:2405-2413)，及在治疗自身免疫神经病诸如 视神经脊髓炎和重症肌无力中是有效的（Pittock等Lancet Neurol 2013,12:554-562; Howard等Muscle Nerve 2013，48:76-84)〇
[0007] 除了全长的抗体，在文献中描述了靶向C5的单链可变片段（scFV )、小体 (minibody)和适配体。这些C5抑制物可结合在C5分子的不同位点(表位)并且可具有不同的 作用模式。例如，依库丽单抗在转化酶裂解位点的一定距离处与C5相互作用，而小体 Mubodina?与C5的裂解位点相互作用。来自于软蜱非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata) 的C5抑制蛋白非洲钝缘蜱补体抑制物（0mCI，Nunn，M.A·等了11111111111〇1 2005，174:2084-2 0 9 1 )已被猜测结合至在转化酶裂解位点附近的C U B - C 5 d - M G 8超级结构域的远端 (FredsIund等Nat Immunol 2008，9(7): 753-760)。与上述提到的抑制C5裂解的三种蛋白不 同，单克隆抗体TNX-558结合至在完整的C5和释放的C5a均存在的C5a表位而不抑制C5的裂 解（Fung等Clin Exp Tmmunol 2003，133(2):160-169)〇
[0008] 包含C5结合基序的C5结合多肽，公开在国际专利申请号PCT/SE2013/050139,作为 WO 2013/126006公布。特别是，WO 2013/126006公开了由氨基酸序列
[0009] EX2X3X4A X6X7EID XiiLPNL Xi6XnXisQW X21AFIX25X26LX28D组成的C5结合基序BM，
[0010] 其中彼此独立地，
[0011] X2 选自 H、Q、S、T和 V;
[0012] X3选自 I、L、M和V;
[0013] X4选自 A、D、E、H、K、L、N、Q、R、S、I^PY;
[0014] X6选自 N和 W;
[0015] X7选自 A、D、E、H、N、Q、R、S和 T;
[0016] X11选自 A、E、G、H、K、L、Q、R、S、I^PY;
[0017] Xi6 选自 N和 T;
[0018] X17选自 I、L和V;
[0019] Xi8选自 A、D、E、H、K、N、Q、R、S和T;
[0020] X2i选自 I、L和V;
[0021] X25选自 D、E、G、H、N、S和T;
[0022] X26选自K和S;并且
[0023] X28 选自 A、D、E、H、N、Q、S、I^PY。
[0024] 特定C5结合基序的例子，如之前在WO 2013/126006中公开的，在本专利申请中如 SEQ ID NO: 1-248所示。
[0025] 从WO 2013/126006可知，额外的肽或多肽可增强C5结合多肽的稳定。这种多肽的 一个例子是如本说明书中的SEQ ID N0:250所示的白蛋白结合结构域(ABD)。合适的白蛋白 结合结构域的其他例子公开在WO 2009/016043和WO 2012/004384^BD延伸的多肽在体内 结合至血清白蛋白，并且得益于其较长的半衰期，增加多肽自身的净半衰期(见例如WO 91/ 01743)〇
[0026] 持续提供具有相当的C5阻断活性的试剂依然在本领域是实质利益问题。特别是， 对防止末端补体级联和促炎分子C5a形成的分子存在持续需要。提供这种分子在疾病治疗 中的用途也是很有用。
[0027] 附图简述
[0028] 图1图解SDS-PAGE凝胶，其中条带代表C5结合化合物PSI0242(SEQ ID N0:249)(0) 稳定性测试之前;和(2w)两周稳定性测试之后。
[0029]图2是稳定性测试之前（实线）和两周稳定性测试之后(虚线）来自于PSI0242(SEQ ID NO:249)的反相HPLC的色谱图。
[0030] 图3图解SDS-PSGE凝胶，其中第一泳道包含SeeBlue 2P大小标记物并且条带代表 (〇)起始样品；和（2w)两周稳定性测试之后的样品。图3A:SEQ ID N0:249;图3B:SEQ ID NO: 261;图3C:SEQ ID N0:262;图3D:SEQ ID N0:264。
[0031] 图4是稳定性测试之前(实线)和两周稳定性测试之后(虚线)来自于C5结合化合物 (SEQ ID N0:253)的反相HPLC的色谱图。
[0032] 图5是稳定性测试之前（实线）和两周稳定性测试之后（虚线）来自C5结合化合物 (SEQ ID NO:264)的反相HPLC的色谱图。
[0033]图6A-D显示SDS-PAGE凝胶图像，比较两周稳定性测试之前（0)和之后（2w)原始的 和修饰的多肽变体。分子大小标记物(Mw)是]Sfovex? Sharp预染蛋白标准（216、160、110、 80、60、50、40、30、20、15、10、3.51^^)。图6六显示册1?2结合多肽的凝胶，其中泳道显示泳道1 : Mw，泳道2:(0)Z02891(SEQ ID N0:272)，泳道3:(2w)Z02891(SEQ ID N0:272)，泳道4:Mw，泳 道5:(0)Z17341(SEQ ID N0:273)，泳道6:(2w)Z17341(SEQ ID N0:273)，泳道7:(0)Z17342 (SEQ ID N0:274)，泳道8:(2w)Z17342(SEQ ID N0:274)。图6B是PDGF-肋结合多肽的凝胶， 其中泳道显示：泳道l:Mw，泳道2:(0)Z15805(SEQ ID N0:275)，泳道3:(2w)Z15805(SEQ ID N0:275)，泳道4:Mw，泳道5:(0)Z17343(SEQ ID N0:276)，泳道6:(2w)Z17343(SEQ ID NO: 276)，泳道7:(0)Z17344(SEQ ID N0:277)，泳道8:(2w)Z17344(SEQ ID N0:277)。图6C显示 FcRn结合多肽的凝胶，其中泳道显示：泳道I: (0)Z10103(SEQ ID N0:278)，泳道2: (2w) Z10103(SEQ ID N0:278)，泳道3:Mw，泳道4:(0))Z17347(SEQ ID N0:279)，泳道5:(2w) Z17347(SEQ ID N0:279)，泳道6:(0)Z17348(SEQ ID N0:280)，泳道7:(2w)Z17348(SEQ ID N0:280)。图6C中见到的对角线的条带是由于在同一个容器内来自于第二次凝胶染色的印 记造成的伪迹。图6D是CAK结合多肽的凝胶，其中泳道显示泳道I: Mw，泳道2 : (O) Z09782 (SEQ ID N0:281)，泳道3:(2w)Z09782(SEQ ID N0:281)，泳道4:Mw，泳道5:(0)Z17351(SEQ ID N0:282)，泳道6:(2w)Z17351(SEQ ID N0:282)，泳道7:(0)Z17352(SEQ ID N0:283)，泳 道8:(2w)Z17352(SEQ ID N0:283)，泳道9:(0)Z17355(SEQ ID N0:284)，泳道 10:(2w) Z17355(SEQ ID N0:284)，泳道 11:(0)Z17357(SEQ ID N0:285)，泳道 12:(2w)Z17357(SEQ ID N0:285)，泳道 13:(0)Z17359(SEQ ID N0:286)，泳道 14:(2w)Z17