所 述色谱条件如下：
[0050] 流动相C为纯甲醇，流动相D为纯水，柱温30°C，检测时间为5min，进样量为20μ1;
[0051] 采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1;
[0052]表1为梯度洗脱参数
[0053]
[0054] 25羟基维生素 D3衍生物的保留时间为3.6min;[0055] 25羟基维生素 D2衍生物的保留时间为3.8min;[0056] 所述多反应监测MRM质谱参数见表2，[0057]表2为质谱参数[005P1
[005?
[0060] 所述内标为 25-OHD3-26，26，26，27，27，27-d6。
[0061] 所述质谱条件还包括正离子模式下，采用APCI离子源，检测离子对m/z分别是:25_ 0HD3-PTAD 558 · 4-298 · 2、25-OHD2-PTAD 570 · 4-298 · 2、内标564 · 4-298 · 2，离子源位置 为2.0;气帘气(⑶R)为10,碰撞气(CAD)为6,离子喷雾电流(NC)为4,温度为600 °C，离子源气 流(GS1)为60。，所述内标溶液浓度为50ng/ml。所述样本前处理中的衍生包括5min涡旋处 理。所述衍生剂为4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮，浓度为200μg/ml。所述涡旋采用涡旋混 匀器。所述涡旋混匀器的转速为2500rpm。所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本、质控干 血斑样本和需要检测的血斑样本。所述干血斑标准曲线样本的制备：取2ml处理过的全血， 分别与 4以1、1(^1、2(^1、5(^1、10(^1、20(^1浓度为叫8/1111的25-0!10混匀，即得2-100即/1111干 血斑标准曲线样本，分别取75μ1制备好的上述样本滴到903滤纸上晾干即得。所述质控干血 斑样本的制备:取2ml处理过的全血，分别与16μ1、40μ1、80μ1浓度为lμg/ml的25-OHD混匀， 即得8ng/ml (Ql)、20ng/ml (Q2)、40ng/ml (Q3)质控干血斑样本，分别取75μ1制备好的上述样 本滴到903滤纸上晾干即得。所述处理过的全血通过将全血离心，去除上层血浆，将血细胞 用0.9 %生理盐水洗涤3次后，与生理盐水1:1混匀即得。
[0062] 干血片样品中25羟基维生素 D的液相色谱串联质谱检测的试剂盒，所述试剂盒包 含以下组分：
[0063] (1)洗脱液：
[0064] 洗脱液C:甲醇，纯度为100%;
[0065]洗脱液D:纯水；
[0066] (2)标准曲线干血片样品：含25羟基维生素 D2，25羟基维生素 D3的干血片，浓度为 0-100ng/ml；
[0067] (3)内标溶液:含有d6-25羟基维生素 D3的甲醇溶液；
[0068] (4)萃取剂:丙酮，纯度为100%;
[0069] (5)衍生液:200μg/ml的4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD);
[0070] (6)终止液：乙醇，纯度为100%;
[0071] (7)复溶液:80%的甲醇；
[0072] (8)质控品干血片样品：含有25羟基维生素 D2,25羟基维生素 D3的干血片样品，浓 度分别为QC1: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml;
[0073]所述试剂盒的组分如下表：
[0074]
[0075] 具体实施例
[0076] 1、全血基质制备
[0077] 将全血离心，去除上层血浆，留血细胞待用。将血细胞用0.9%生理盐水洗涤3次 后，与生理盐水1:1混匀即得处理过的全血。
[0078] 干血斑标准曲线样本及质控干血斑样本(QC血片）制备
[0079] 所述干血斑标准曲线样本的制备:取2ml处理过的全血，分别与4μ1、?ομL、20μ1、50 μL、100μΙ、200μ1浓度为lμg/ml的25-OHD混匀，即得2-100ng/ml干血斑标准曲线样本，分别 取75μ1制备好的上述样本滴到903滤纸上晾干即得。
[0080] 所述质控干血斑样本的制备:取2ml处理过的全血，分别与16μ1、40μ1、80μ1浓度为 lμg/ml的25-OHD混勾，即得8ng/ml(Ql)、20ng/ml(Q2)、40ng/ml(Q3)质控干血斑样本，分别 取75μ1制备好的上述样本滴到903滤纸上晾干即得。以、〇2、〇3，是三个浓度不同的质控品， 分别是低、中、高浓度的质控品。
[0081 ] 2、样本前处理
[0082] 萃取：用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液（10yl，50ng/ml)的2ml离心管 中，加入500μ1丙酮，超声提取30min后，以转速2500rpm在涡旋混匀器中涡旋30min。将提取 液转移到2ml离心管中，60°C吹干。
[0083] 衍生:将100μΙ衍生剂加入到吹干后的残渣中，室温下反应lh(含5min涡旋）后，加 入80μ1乙醇，涡旋5min，60°C吹干。
[0084] 复溶：50μ1 80%甲醇复溶，以转速2500rpm在涡旋混匀器中涡旋5min，以转速 13000rpm离心3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析。
[0085] 3、色谱条件
[0086] 流动相:C相为纯甲醇一D相为纯水，柱温30°C，检测时间5min，进样量20μ1。
[0087]表1洗脱梯度
[0088]
[0089] 4、质谱条件
[0090] 正离子模式下，采用APCI离子源，MRM检测方式检测，检测离子对(m/z)分别是:25_ 0HD3-PTAD 558 · 4-298 · 2、25-OHD2-PTAD 570 · 4-298 · 2、内标564 · 4-298 · 2，离子源位置 为2.0。气帘气(⑶R)为10,碰撞气(CAD)为6,离子喷雾电流(NC)为4,温度为600 °C，离子源气 流(GS1)为60。聚焦电势(DP)、入口电势(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口（CXP)电势见表2。
[0091] 表2质谱相关参数设置
[0092]
[0093] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护 范围为准。
【主权项】
1. 干血片样品中25?基维生素 D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下 步骤： (1) 样本前处理:用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液10山的第一离屯、管中，加 入50化1丙酬，超声提取30min后，满旋30min得到提取液;将提取液转移到第二离屯、管中，60 °C吹干； 衍生:将10化1衍生剂加入到吹干后的残渣中，室溫下反应1小时后加入SOiil乙醇，满旋 5min，60°C 吹干； 复溶:将50iil 80%甲醇加入衍生吹干后的残渣中进行复溶，满旋5min，W1300化pm的 转速离屯、3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析； (2) 采用高效液相色谱串联质谱技术检测经上述处理的干血片样品中25径基维生素 D， 其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下： 流动相C为纯甲醇，流动相D为纯水，柱溫30°C，检测时间为5min，进样量为20山； 采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1; 表1为梯度洗脱参数25径基维生素 D3衍生物的保留时间为3.6min; 25径基维生素 D2衍生物的保留时间为3. Smin; 所述多反应监测MRM质谱参数见表2， 表2为质谱参数2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用 APCI离子源，检测离子对m/z分别是：25-OHD3-PTAD 558.4一298.2、25-OHD2-PTAD 570.4一 298.2、内标564.4一298.2,离子源位置为2.0;气帘气(CUR)为10,碰撞气(CAD)为6,离子喷 雾电流(NC)为4,溫度为600°C，离子源气流(GSl)为60。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标溶液浓度为50ng/ml。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生剂为4-苯基-1，2，4-S挫嘟-3，5-二酬，浓度为20化g/ml。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述满旋采用满旋混匀器。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述满旋混匀器的转速为2500rpm。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本、 质控干血斑样本和需要检测的血斑样本。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述干血斑标准曲线样本的制备:取2ml处 理过的全血，分别与钮1、IOiil、20iil、50iU、IOOiil、200iU浓度为化g/ml的25-0皿混匀，即得 2-lOOng/ml干血斑标准曲线样本，分别取75iil制备好的上述样本滴到903滤纸上惊干即得。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述质控干血斑样本的制备:取2ml处理过 的全血，分别与1641、4化1、8041浓度为化旨/1111的25-0皿混匀，即得加旨/1111(91)、20叫/1111 (Q2)、40ng/ml(Q3)质控干血斑样本，分别取75iU制备好的上述样本滴到903滤纸上惊干即 得； 所述处理过的全血通过将全血离屯、，去除上层血浆，将血细胞用0.9%生理盐水洗涂3 次后，与生理盐水1:1混匀即得。10. 干血片样品中25径基维生素 D的液相色谱串联质谱检测的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒包含W下溶液： (1) 洗脱液： 洗脱液C:甲醇，纯度为100%; 洗脱液D:纯水； (2) 标准曲线干血片样品：含25径基维生素02,25径基维生素 D3的干血片，浓度为0-lOOng/ml； (3) 内标溶液:含有(16-25?基维生素 D3的甲醇溶液； (4) 萃取剂:丙酬，纯度为100 %; (5) 衍生液:200μg/ml的4-苯基-1，2，4-S挫嘟-3，5-二酬(PTAD); (6) 终止液：乙醇，纯度为100 % ; (7) 复溶液:80%的甲醇； (8) 质控品干血片样品：含有25径基维生素02,25径基维生素 D3的干血片样品，浓度分 别为QCl: 8ng/ml; QC2:20ng/ml; QC3:40ng/ml。
【专利摘要】本发明涉及一种干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其前处理工艺，主要包括样本前处理、衍生、复溶工序，同时采用多反应监测MRM扫描方式，该方法实现干血片中25羟基维生素D的高通量液相色谱串联质谱检测，解决传统液相色谱串联质谱方法样本量需求量量大、采样、运输不方便的问题，通过对检测技术的改进，实现干血片中25羟基维生素D的检测，检测者可在家自行采集，样本需求量减小，采样、运输方便。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105651901
【申请号】
【发明人】何健, 郭玉梅, 宋晓涛
【申请人】北京洛奇临床检验所股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月11日