44] 在一些实施例中，用于检测多种呼吸道病原体的PCR反应液包括上述至少两对PCR 引物对以及相应的至少两条分子信标探针。较优的是，在PCR反应液中，还可以设有内参照 引物和内参照探针，内参照引物和内参照探针可以根据人基因组保守基因或样品提取中另 外加入的已知阳性质控品常规设计。
[0045] 在一些实施例中，PCR反应液中除上述引物和探针外，还可以包括DNA聚合酶、10 X Buffer、dNTP等，以进行PCR反应液的配制和一步法PCR扩增。扩增程序可以包括高温变性、 低温复性、72 °C延伸等。
[0046] 在一些实施例中，探针与PCR产物的结合及熔解程序如下:在低温(例如30°C_40°C 范围内）下，各探针与对应病原体的PCR产物结合后，随着温度的逐步升高，探针依其Tm顺 序，逐个与产物解链分离，荧光信号减弱。最终依靠荧光变化时的温度，确定待检样品的基 因型。
[0047] 在一些实施例中，用于检测多种呼吸道病原体的试剂盒包括至少一人份上述PCR 反应液。
[0048] 以下通过具体的实施例进行进一步说明。
[0049] (a)样品收集
[0050]收集待检者鼻咽拭子样品。
[00511 (b)样品病原体的DNA提取
[0052]使用市售DNA提取试剂盒提取病原体DNA，具体操作过程按其说明书进行。
[0053] (c)引物设计
[0054] 从GenBank中找出拟检测的6种病原体的保守基因序列，分别设计扩增引物，确保 每对引物能够扩增出病原体的种类，并且不与其它病原体发生非特异扩增。
[0055] (d)多重PCR扩增6种不同类型的病原体
[0056] 针对6种病原体，可以直接进行多重PCR扩增。即在一管中同时加入这6种病原体的 引物进行PCR扩增。
[0057] (e)分子信标探针设计
[0058] 在引物的扩增区域内，分别设计这6种病原体的分子信标探针，每一条探针整体为 茎环结构，两端为互补的茎结构，中间为能与每种PCR产物特异杂交的环状结构。应保证每 个探针的特异性，使非特异杂交的Tm值低于特异熔解曲线峰值范围（也即非特异杂交的Tm 值小于55°C)，以免对熔解曲线分析造成影响。所有探针可以用相同的荧光基团标记，也可 以用不同的荧光基团标记，本例中分成三种荧光标记，相同荧光标记探针的Tm设计成一定 的梯度，一般差异在2 °C以上，熔解温度范围在55 °C~80 °C。
[0059] 将所有分子信标探针加入PCR反应液中，最终的一管PCR反应液基本组成如下：
[0060]
[00611 (f)多重PCR恪解曲线分析
[0062] 多重PCR扩增及熔解曲线分析基本程序设置如下：
[0063]
40〇C^80 C O.rC/s多色荧光熔解曲线分析
[0064] 最后根据熔解曲线峰图，确定样品是否感染了待检的这6种病原体，若为感染阳 性，则可根据荧光类型和熔解曲线峰对应的温度，判断出所感染的病原体类型，整个检测流 程约为4小时。
[0065] 参见图1至图3所示的实验检测数据，其中，图1示出了腺病毒（AdV)、博卡病毒 (HBoV)的FAM荧光熔解曲线，图2示出了嗜肺军团菌(LP)、百日咳博德特氏菌(BP)的HEX荧光 熔解曲线。图3示出了肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)的TAMRA荧光熔解曲线。最后根据熔 解曲线峰图，确定样品流感病原体种类。各型流感病原体对应的熔解峰值见下表3:
[0066] 表 3
[0067]
[0068] 以上实施例是可以同时检测6种呼吸道病原体的示例，在其他实施例中，也可以同 时只检测其中2种或3种或4种或5种呼吸道病原体。
[0069] 以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能 认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型， 而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括以下至 少两对引物对： 由序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示的两条序列组成的针对腺病毒的引物对； 由序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两条序列组成的针对博卡病毒的引物 对； 由序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条序列组成的针对嗜肺军团菌的引 物对； 由序列表中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两条序列组成的针对百日咳博德特氏 菌的引物对； 由序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示的两条序列组成的针对肺炎衣原体的引 物对； 由序列表中SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12所示的两条序列组成的针对肺炎支原体的 引物对。2. 用于检测多种呼吸道病原体的探针组，其特征在于，所述探针组包括以下至少两条 分子信标探针： 由序列表中SEQ ID NO. 13所示的序列或其反向互补序列组成的针对腺病毒的分子信 标探针； 由序列表中SEQ ID NO. 14所示的序列或其反向互补序列组成的针对博卡病毒的分子 ig标探针； 由序列表中SEQ ID NO. 15所示的序列或其反向互补序列组成的针对嗜肺军团菌的分 子信标探针； 由序列表中SEQ ID NO.16所示的序列或其反向互补序列组成的针对百日咳博德特氏 菌的分子信标探针； 由序列表中SEQ ID NO. 17所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎衣原体的分 子信标探针； 由序列表中SEQ ID NO. 18所示的序列或其反向互补序列组成的针对肺炎支原体的分 子信标探针； 每一条分子信标探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。3. 如权利要求2所述的探针组，其特征在于，每一条所述分子信标探针的整体为茎环结 构，两端为互补的茎结构，中间为与对应呼吸道病原体扩增产物特异杂交的环状结构。4. 如权利要求2所述的探针组，其特征在于，每一条所述分子信标探针的熔解温度范围 在55°C~80°C，至少两条所述分子信标探针中若具有相同的荧光基团，则具有相同荧光基 团标记的分子信标探针的Tm设计成一定的梯度，差异在2 °C以上。5. 如权利要求2-4任意一项所述的探针组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX和 TAMRA，所述淬灭基团为Dabcyl。6. 用于检测多种呼吸道病原体的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包含权利要 求1中所述的PCR引物组和权利要求2-5任一项所述的探针组。7. 用于检测多种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，包括至少一人份权利要求6所述 的PCR反应液。
【专利摘要】本发明公开了用于检测多种呼吸道病原体的PCR引物组、探针组及试剂盒；其中所述PCR引物的各序列为SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.12，所述探针包括两端分别带有荧光基团和淬灭基团的6条呼吸道病原体的分子信标探针中的至少两条，各序列为SEQ？ID？NO.13～SEQ？ID？NO.18。本发明还公开包含以上PCR引物和探针的PCR反应液，以及包含至少一人份PCR反应液的试剂盒。利用本发明，可以快速准确地分型检测6种呼吸道病原体。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105648115
【申请号】
【发明人】廖生赟, 许爱华, 冯传欣, 孙芳, 丁俊, 田梦
【申请人】深圳市亿立方生物技术有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月26日