一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序 方法。
【背景技术】
[0002] 对于病毒基因组测序，特别是RNA病毒的基因组测序，目前比较成熟，应用广泛的 方法是设计扩增不同序列区域的引物，分段扩增并克隆到载体上，使用载体通用引物或特 异性引物进行序列测定。最后结合5'/3'RACE技术，得到573'两端的序列，将所有测序的序 列拼接，而获得病毒全基因组序列。
[0003] 目前该方法在鸭甲型肝炎病毒(DHAV)的全基因组序列测定也得到广泛应用，但鸭 甲型肝炎病毒分为好多不同的基因型，比如基因1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)、基因2型鸭 甲型肝炎病毒(DHAV-2)、基因3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)等，按常规的策略，按每一种基 因型设计合成一套测序引物和5 73 ' RACE引物，就需要3套，假如某些位点发生变异，有可能 导致测序失败，另外对于未知基因型鸭甲型肝炎病毒，还需要先进行鉴定，比较麻烦。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种新的简便的鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法。 本发明设计了一套通用测序引物，通过用同一套引物就可以对不同基因型鸭甲型肝炎病毒 DHAV-1、DHAV-2及DHAV-3进行全基因测序列，即降低了分段克隆的劳动量，又节省了测序时 间与成本。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] -种鸭甲型肝炎病毒基因组序列通用测序方法，包括如下步骤：
[0007] (1)提取DHAV RNA，并通过反转录制备DHAV cDNA。
[0008] (2)DHAV基因组5'端和3'端的扩增：使用5'RACE试剂盒、引物5gpslout和5gpslin 按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组5 '端；使用3 ' RACE试剂盒、引物3GPSl-〇ut和 3GPSl-in按照试剂盒说明套式PCR扩增DHAV基因组3 '端，将扩增的DHAV基因组5 '端和3 '端 进行胶回收纯化备用。
[0009] (3)DHAV基因组大片段的扩增：以DHAV CDNA为模板，分别使用引物对DHV3897A-F、 DHV3897A-R 和 DHV4867B-F、DHV4867B-R 进行 PCR 扩增，分别得到 3897bp 和 4867bp 左右产物， 将两扩增产物进行胶回收纯化备用。
[0010] (4)将步骤(2)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成 功的菌株送测序公司进行测序，测序引物为T载体测序引物。
[0011] 将步骤(3)的扩增产物分别与T载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，转化成功的 菌株送测序公司分别以引物对F1-F和F1-R、F2-F和F2-R、F3-F和F3-R、F4-F和F4-R、F5-F和 F5-R、F6-F和F6-R、F7-F和F7-R、F8-F、F8-R作为测序引物进行测序。
[0012] (5)以已知的DHAV全基因组序列为参考，将各测序片段进行组装。
[0013] 上述各引物序列如下：
[0014] 5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；
[0015] 5gps1 in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；
[0016] 3GPSl-〇ut：TGTGTTGGMTATGACATC；
[0017] 3GPSl-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；
[0018] DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG,
[0019] DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；
[0020] DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG,
[0021 ] DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
[0022] Fl-F：TTGCTGTGTTGGGMTATGACATCA,
[0023] F1-R：GGGTGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
[0024] F2-F：AAGCTAGTGAYAARTATATTGG,
[0025] F2-R：TCTCCATAGCTRACRACATA；
[0026] F3-F：ATACTTGGAATWGGAMCACTTGG,
[0027] F3-R：GAATTTGATCCAKRACATCCTGT；
[0028] F4-F：ATTATGTTAGCAYTGTGTGATG,
[0029] F4-R：GGAGTCCAATTGAGTRAAYTTAGA；
[0030] F5-F：AAAAATGTATCGYCAYTATGGTGT,
[0031 ] F5-R：GTTCGGGTCGGTGWGTCCAYTCCA；
[0032] F6-F：TTGCGSTTYTTTGCCTATTT,
[0033] F6-R：CCCAATGCTRCAGCCCACAT；
[0034] F7-F:CCCTATGCCATCTTGGATCT，
[0035] F7-R：GGGATAAGAAYACYCCCCAT；
[0036] F8-F:CCAAACCCCTTAATTCAACG，
[0037] F8-R:ATCAACAGI^TI^GAGGTTCC。
[0038] 引物序列中，W代表碱基G或T，M代表碱基A或C，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，K 代表碱基G或T，S代表碱基G或C。
[0039] 所述的鸭甲型肝炎病毒包括DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3。
[0040] 步骤(3)中的PCR扩增优选为:先以cDNA为模板，进行长片段PCR扩增，所用Taq酶为 LA Taq，扩增反应程序为:941€3111丨11;94°(：11^11，68°(：151^11，20个循环 ;72°(：1〇1^11。再以纯化 后的长片段PCR扩增产物为模板进行PCR扩增，所用Taq酶为Ex Taq，扩增反应程序为:94°C 3min; 94°C lmin，58 °C 2min，72 °C 2min，20 个循环；72 °C 20min。
[00411步骤(4)中的T载体优选为pGEM-T载体，大肠杆菌优选为Top 10菌株。
[0042] 本发明通过对3种不同基因型的鸭甲型肝炎病毒(0说￥-1、0撤￥-2、0说￥-3)全基因 组序列进行比对，在序列保守区分别分段设计兼并引物，其中两对扩增部分重叠区的大片 段引物（DHV3897A-F、DHV3897A-R 和 0狀486784、0狀48678-1〇，扩增范围除了5'17^和3'17^ 部分序列外，包含大部分基因组序列，以鸭甲型肝炎病毒cDNA为模板用此两对引物进行扩 增，并将扩增片段构建到T载体。在这两对引物扩增大片段区域内，在保守区分别设计8个扩 增区域部分重叠的小片段(F1-F8)测序引物。通过本发明方法，节省了构建测序克隆的数 量，降低了工作量，同时解决了长片段测序要根据已测序列再设计合成测序引物的问题，节 省了测序时间。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
[0043] (1)由于将克隆测序片段减少，所以可降低构建克隆的工作量。
[0044] (2)根据保守区设计了测序引物，因此可以直接walk，不用等部分序列出来后再设 计合成测序引物，节省测序列时间。
[0045] (3)-套引物便可实现对3种基因型DHAV的全基因测序，具有很好通用性。
【附图说明】
[0046] 图1是DHAV全基因序列通用测序方法的原理图。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0048] 实施例1兼并引物的设计与合成
[0049] 从NCBI网站以fasta格式下载DHAV 3个基因型的全基因组序列，使用生物学软件 BioEdit进行Clustal W多序列比对，根据比对结果查找序列保守区，并以保守区为引物设 计选定区，使用引物设计软件Oligo进行兼并引物设计与评价，对符合要求的引物送生物公 司进行合成，序列合成要求PAGE纯化级。各引物序列如下：
[0050] 5gps1out：CAATATTTCAGCACCACCTCC；
[0051 ] 5gps1 in：GGCCAAGGGRTGGTWGGCTAA；
[0052] 3GPSl-〇ut：TGTGTTGGMTATGACATC；
[0053] 3GPSl-in：TTGAGTTTYTGAAGAGAAC；
[0054] DHV3897A-F：TCCCRAMCCCCTTAATTCAACG,
[0055] DHV3897A-R：TCCAACTCATGCTRGTGGCATCT；
[0056] DHV4867B-F：CAGGCCCTATTWTRGTTGTTGG,
[0057] DHV4867B-R：GGGTGGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
[0058] Fl-F：TTGCTGTGTTGGGMTATGACATCA,
[0059] F1-R：GGGTGGGRGGAATAGTAAAGTAAA；
[0060] F2-F：AAGCTAGTGAYAARTATATTGG,
[0061 ] F2-R：TCTCCATAGCTRACRACATA；
[0062] F3-F：ATACTTGGAATWGGAMCACTTGG,
[0063] F3-R：GAATTTGATCCAKRACATCCTGT；
[0064] F4-F：ATTATGTTAGCAYTGTGTGATG,
[0065] F4-R：GGAGTCCAATTGAGTRAAYTTAGA；
[0066] F5-F：AAAAATGTATCGYCAYTATGGTGT,
[0067] F5-R：GTTCGGGTCGGTGWGTCCAYTCCA；
[0068] F6-F：TTGCGSTTYTTTGCCTATTT,
[0069] F6-R：CCCAATGCTRCAGCCCACAT；
[0070] F7-F:CCCTATGCCATCTTGGATCT，
[0071 ] F7-R：GGGATAAGAAYACYCCCCAT；
[0072] F8-F:CCAAACCCCTTAATTCAACG，
[0073] F8-R:ATCAACAGI^TI^GAGGTTCC。
[0074] 引物序列中，W代表碱基G或T，M代表碱基A或C，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，K 代表碱基G或