对治疗性化合物敏感性降低的乙型肝炎变异株、变异株的检测及其用图
【专利说明】对治疗性化合物敏感性降低的乙型肝炎变异株、变异株的检测及其用途
[0001 ] 本申请是分案申请，原申请的申请日为2009年4月3日，申请号为200980113181.6(PCT/CN2009/000364)，发明名称为“对治疗性化合物敏感性降低的乙型肝炎变异株、变异株的检测及其用途”。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求保护2008年4月5日提交的美国临时申请顺序号61/042,721的权益，该申请通过引用其整体结合到本文中。
[0004]发明背景
[0005]乙型肝炎病毒(HBV)感染是影响世界范围大约20亿人口的严重的全球性健康问题。大约4亿受HBV感染的人是长期携带者。每年约I百万人死于各种HBV疾病，例如慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC)(世界卫生组织(World Health Organizat1n) ,2000)。这种疾病在西方国家相对较少，主要在成人期得病。然而，该疾病在亚洲和非洲国家实际上是流行病，其中大多数慢性HBV感染是在围产期或儿童期获得的。
[0006]乙型肝炎病毒(HBV)是一种约3200个碱基的小DNA病毒，具有广泛的序列变异性。目前已确定的有8种基因型(A?H)。
[0007]这种病毒可引起虚弱性疾病症状。急性感染可能导致肝衰竭，但这种情况极少见。在出生时或在婴儿期受到感染的人，90%以上的乙型肝炎感染会发展成慢性形式。在25-40 %患者中，慢性感染最终导致肝硬化和肝癌。据估计，HBV引起全球30 %的肝硬化和50 %的HCCXPerz等，2006)。这个沉重的负担使得开发有效用于降低HCC风险的抗病毒疗法的需求变得十分突出(Liaw等，2004)。监测患者对这类疗法的反应也因此十分重要。
[0008]HBV主要是垂直传播，病毒由受感染的母亲传给出生时的婴儿。婴儿也可通过与受感染的父母和兄弟姐妹紧密接触而被感染。HBV也可通过性接触或与受感染血液接触而水平传播。
[0009]该病毒通过RNA中间体复制，并利用在其复制策略中缺乏校正能力的反转录。HBV基因组部分是双链，在4个重叠可读框中编码包膜、前核心(precore)/核心、反转录酶/聚合酶和X基因。
[0010]包膜蛋白抗原称为HBsAg(乙型肝炎表面抗原)，它构成病毒的外表层。核心蛋白抗原称为HBcAg(乙型肝炎核心抗原)，它构成包裹HBV DNA的病毒核心。前核心蛋白抗原称为HBeAg(乙型肝炎e抗原)，其功能不详。X蛋白抗原称为HBxAg(乙型肝炎X抗原)，其确切功能也不详。
[0011]聚合酶基因与包膜基因重叠。因此，影响聚合酶基因的催化结构域的突变也可影响包膜蛋白的蛋白质序列，反之亦然。
[0012]慢性乙型肝炎感染的现行治疗包括干扰素和核苷/核苷酸类似物。遗憾的是，用干扰素治疗有许多副作用，且只有少数患者对治疗起反应。
[0013]核苷或核苷酸类似物是经化学方法改造的核苷酸，被开发用作在病毒复制期间抑制病毒DNA合成的取代结构单元。目前已获准(在美国)用于慢性乙型肝炎治疗的核苷和核苷酸类似物为:拉米夫定(Iamivudine) (3TC或LMV)、替比夫定(telbivudine) (L-dT)、恩替卡韦(entecavir) (ETV)、阿德福韦(adefovir) (ADV)和替诺福韦(tenofovir)。
[0014]虽然这些化合物在抑制HBV DNA合成方面已见成效，但是它们需要长期治疗，而且在长期治疗中，存在出现抗药性突变型HBV毒株的可能。在用LMV长期治疗的患者中，赋以普遍抗药性的突变为rtM204I/V+/-rtL180M(Allen等，1998)以及其它突变。在一些患者中，在长期治疗时出现在HBV DNA聚合酶基因的B、C和D结构域上携带突变的抗药性病毒毒株。因此与LMV治疗而无抗药性病毒的患者相比，这些患者具有较高的发生HCC的风险。
[0015]另外，在乙型肝炎e抗原(HBeAg)血清转化的过程中，因免疫压力下的选择所致出现前核心和核心启动子突变体。这些前核心突变体意味着会引起更严重的HBV感染。核心启动子突变体，在引起前核心mRNA转录和HBeAg产生降低的同时提高病毒复制，同样与HCC的发生有关。
[0016]Kazim等人(2006)报道了核心启动子和YMDD基序突变与在进行长期LMV疗法的患者中的病毒突破(viral breakthrough)有关。同样，在接种HBV疫苗的儿童中，在肝移植后接受抗HBV免疫球蛋白疗法的患者中，在具有隐伏感染的患者中(Weber，2005)以及在用LMV治疗的患者中(Torresi等，2002)，发现了编码表面抗原的基因变异体。
[0017]HBV疫苗的保护是基于针对HBV表面抗原(HBsAg)的主要抗原表位的抗体的诱导。对于患有乙型肝炎相关的末期肝病并已进行肝移植的患者，通过给予从已接种疫苗的受治疗者中得到的乙型肝炎免疫球蛋白，来针对复发性HBV感染提供预防。此外，免疫逃逸HBV突变体的出现即使在有足够抗体效价的情况下也导致病毒持续感染。
[0018]因此，开发有效的抗病毒疗法需要用于监测抗药性HBV毒株出现的方法以及开发检测和鉴定这些抗药性病毒的测定法，以使得临床医生可以在出现抗药性时及时改用不同的治疗方案。
[0019]多项研究指出全球不同基因型的发生率(Lindh，M，Anderson AS,GusdalA.Genotypes ?nt 1858variants ?and geographic origin of hepatitis B virus—large-scale analysis using a new genotyping method(乙型肝炎病毒的基因型、nt1858变异株和地理起源--采用新的基因型分型方法进行大规模分析).J Infect Dis1997；175:1285-1293；Chan HLY，Tsui SKff?Tse C_H，Ng EYT，Au TCC，Yuen L，Bartholomeusz A?Leung K_S，Lee K_H，Locarnini S?Sung JJY.Epidem1logical andvirological characteristics of 2subgroups ofhepatitis B virus genotype C(乙型肝炎病毒C基因型2亚型的流行病学和病毒学特征).J Infect Dis 2005；191:2022-2032；以及Yuen M-F?Sablon E,Yuan H_J，Wong DK-H?Hui C_K，Wong BC-Y?Chan AO-O?LaiCL.Signif icance of hepatitis B genotype in acute exacerbat1n，HBeAgseroconvers1n?cirrhosis-related complicat1ns，and hepatocellular carcinoma(乙型肝炎基因型在急性加重、HBeAg血清转化、肝硬化相关并发症和肝细胞癌中的重要性).Hepatology 2003; 37:562-567)以及不同基因型对疾病并发症(例如肝硬化、HCC的发生)的诱因(Kuang SY，Jackson PE，Wang J-B?Lu P-X?Munoz A，Qian G_S，Kensler Tff ?Groopman JD.Specific mutat1ns of hepatitis B virus in plasma predict livercancer development(血楽中乙型肝炎病毒的特定突变预示肝癌的发生).Proc Natl AcadSciiUSA 2004;101:3575-3580;以及Yuen MF?Sablon E?Wong DKH?Yuan H-J?Wong BC-Y?Chan AOO，Lai CL.Role of hepatitis B virus genotypes in chronic hepatitis Bexacerbat1n(乙型肝炎病毒基因型在慢性乙型肝炎恶化中的作用).Clin Infect Dis2003;37:593-597)以及对治疗的反应(Kao JH,Chen PJ,Lai MY,Chen DS.Hepatitis Bgenotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitisB(乙型肝炎基因型与慢性乙型肝炎患者的临床结果相关联).Gastroenterology 2000 ；118:554-559; 118:554-559;以及Buti M,Cotrina M,Valdes A, Jardi R,Rodriguez-FriasF,Esteban R.1s hepatitis B virus subtype testing useful in predictingvirological response and resistance to lamivudine(乙型肝炎病毒亚型测定可用于预测病毒学应答和拉米夫定抗药性吗)？j Hepatol 2002;36:445-446)。
[0020]为了辅助治疗乙型肝炎患者，开发了基于反向斑点印迹(RDB)等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交技术的各种测试条(test trip)以鉴定基因型(INNO-LiPA HBV基因型分型，Innogenetics NV，Belgium)或突变(INNO-LiPA HBV前核心，Innogenetics NV,Belgium；以及INNO-LiPA DR，Innogenetics NV,Belgium)。因为对于在分析过程中的所有变异株，RDB-ASO原理需要相同的杂交和洗涤条件，所以所有正常和突变体探针可能需要相似的解链温度(Tm) (Saiki RK,Walsh PS,Levenson CH,Erlich HA.Genetic analysis ofamplified DNA with an immobilised sequence-specific oligonucleotide probe(用固定化序列特异性寡核苷酸探针进行的扩增DNA的遗传学分析).Proc Natl Acad Sci ,USA.1989 ;86:6230-6234)。这就给在一个RDB条带上测试>20个突变/基因型提出了限制。目前需要3个单独的测试条来评价8种基因型和12个突变(INNO-LiPA HBV基因型分型，Innogenetics NV,Belgium； INNO-LiPA HBV前核心，Innogenetics NV，Belgium;以及INNO-LiPA DR，Innogenetics NV，Belgium)。其他研究小组设计了寡核苷酸微阵列/芯片，但均应用相同的 RDB-ASO 原理(H，Cho M,Hco J，Kim H, Jun H,Shin W，Cho B，Park H，KimC.01igonucleotide chip for detect1n of lamivudine—resistant Hepatitis BVirus(用于检测拉米夫定抗性乙型肝炎病毒的寡核苷酸芯片).J Clin Microb1l 2004；42:4181