菌ITS序列、玉米圆斑病菌ITS序列、玉米小斑病菌ITS序列进行同源性分析和差异位点比较，用Primer Primer5软件设计了对玉米大斑病菌具有特异性扩增作用的一对PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特异分子检测引物的序列为:
上游引物ESF: 5 ’ -GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3 ’ ；
下游引物ESR: 5 ’ -CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3 ’
4.玉米大斑病菌快速分子检测方法的建立:
(1)从玉米大斑病菌或玉米叶片或玉米叶鞘中提取DNA:
①用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA;
②用于玉米叶片或叶鞘中是否存在玉米大斑病菌时，采用NaOH快速裂解法提取玉米叶片或叶鞘的基因组DNA，具体步骤如下:
a.称取待检测的植物组织0.1 8，加入0.5 mo I/L NaOH 30yL，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5mL离心管中，12000r/min离心6 min，取上清液5μ1 ；
c.上清液中加入495yL0.1 mol/L Tris_HCl(pH=8.0)，混合均匀，取I.0yL 作为PCR模板进行扩增；
(2)以提取的玉米大斑病菌或玉米叶片或玉米叶鞘中的DNA为模板进行PCR扩增:PCR反应体系25yL，包含2.5yL 10XPCR buffer，2.0yU^度为2.5mmol/L的dNTP Mixture,0.15yL浓度为5U/yL的Taq酶，lOymol/L的引物ESF和ESR各0.5yL，DNA模板IyL，加ddH20至总体积达25yL;PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，共 35 个循环;72 °C 延伸 I Omin;
(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5 X TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm;根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出356bp的产物，则判定所述的玉米叶片或叶鞘存在玉米大斑病菌，否则所述的玉米叶片或叶鞘中不存在玉米大斑病菌。
[0021]实施例2玉米大斑病菌特异性扩增
I.采用CTAB法提取2株不同来源的玉米大斑病菌、玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、水稻稻瘟病菌及花生褐斑病菌的基因组DNA。
[0022]2.以提取供试菌的DNA为模板进行PCR扩增:PCR反应体系25yL，包含2.5yL 10XPCR buffer，2.0yL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μ?4^度为5U/yL的Taq酶，10μmol/L的引物ESF和ESR各0.5yL，DNA模板IyL，加ddH20至总体积达25yL;PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，共35个循环；72°C延伸1min;电泳检测扩增产物。
[0023]3.特异性扩增结果
如图1所示，2株玉米大斑病菌可以特异性扩增出356bp的条带，而玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、水稻稻瘟病菌、花生褐斑病菌和阴性对照均无扩增条带，表明本发明的分子检测引物可以将玉米大斑病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于玉米大斑病菌的特异性扩增。
[0024]实施例3本发明引物对玉米大斑病菌的灵敏性检测
1.采用CTAB法提取玉米大斑病菌的基因组DNA;
2.将提取的玉米大斑病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增:PCR反应体系25yL，包含2.5yL10XPCR buffer，2.0yL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture,0.度为5U/yL的Taq酶，10ymol/L的引物ESF和ESR各0.5yL，DNA模板IyL，加ddH20至总体积达25yL ； PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，共35个循环；72°C延伸1min;电泳检测扩增产物。
[0025]4.以配制的成系列浓度DNA为模板进行巢式PCR扩增:
(O第一轮PCR扩增:以真菌核糖体基因转录间隔区(rDNA-1TS)通用引物TS1:5’_TCCGTAGGGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’ 为外引物对配制的成系列浓度DNA进行第一轮PCR扩增，扩增反应体系和反应程序为:PCR反应体系25yL，包含2.5yL 10XPCR buffer，2.0yUfelSS2.5mmol/lJ9dNTP Mixture，0.15yU^度为5U/yL的Taq酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，ΙΟμπιοΙ/L的引物TISl和ITS4各0.5yL，DNA模板lyL，加ddH20至总体积达25yL;PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性I 1^11，55°(:退火4586(3，72°C延伸I min，共35个循环；72°C延伸1min;
(2)第二轮PCR扩增:以第一轮PCR扩增的产物为模板，以ESF/ESR为引物进行第二轮PCR扩增，PCR 反应体系 25yL，包含 2.5yL 1X PCR buffer，2.0yL 浓度为 2.5mmol/L 的 dNTPMixture，0.15yU^度为5U/yL的Taq酶，1ymoI/L的引物ESF和ESR各0.5yL，DNA模板IyL，加ddH20至总体积达25yL;PCR反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性45sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，共30个循环;72°C延伸lOmin;电泳检测扩增产物。
[0026]5.检测结果
如图2所示，以本发明引物ESF/ESR为引物进行常规PCR时，在25yL反应体系中，1pg的玉米大斑病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10pg(图2-A);而进一步以真菌核糖体基因转录间隔区(rDNA-1TS)的通用引物TSl: 5 ’-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3 ’和ITS4:
5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ’为外引物扩增的产物为模板，以本发明引物ESF/ESR为引物进行第二轮扩增时，在25yL反应体系中，1fg的玉米大斑病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到1fg(图2-B)。
[0027]实施例4发病玉米叶片和叶鞘中玉米大斑病菌的检测
1.采用NaOH快速裂解法提取玉米叶片和叶鞘中基因组DNA。
[0028]2.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增:PCR反应体系25yL，包含2.5yL 10XPCR buffer，2.0yUfelSS2.5mmol/U9dNTP Mixture，0.15μ?4^度为5U/yL的Taq酶，ΙΟμπιο 1/L的ESF和ESR各0.5yL，DNA模板IyL，加ddH20至总体积达25yL; PCR反应条件为:94°C 预变性 5min;94°C 变性 45sec，55°C 退火 45sec，72°C 延伸 45sec，共 35 个循环；72°C 延伸1min;电泳检测扩增产物。
[0029]3.检测结果
如图3所示，自然发病的玉米叶片、自然发病玉米叶鞘、人工接种发病的玉米叶片、人工接种发病玉米叶鞘、阳性对照中均可产生356bp左右的可视条带，而健康玉米叶片、健康的玉米叶鞘、健康的玉米苞叶、灭菌玉米叶片、阴性对照均无任何条带出现，表明本发明引物和检测方法还可用于田间玉米叶片和叶鞘大斑病菌的检测。
[0030]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种玉米大斑病菌分子检测引物，其特征在于:所述引物的核苷酸序列为: 上游引物 ESF: 5 ’ -GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3 ’ 下游引物ESR: 5 ’ -CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3 ’。2.根据权利要求1所述玉米大斑病菌分子检测引物，其特征在于，所述上游引物ESF和下游引物ESR对玉米大斑病菌特异性扩增出356bp的产物。3.—种利用权利要求1所述的引物检测玉米大斑病菌的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)提取玉米叶片或者叶鞘的DNA; (2)以提取的玉米叶片或者叶鞘DNA为模板进行PCR扩增:PCR反应体系25yL，包含2.5μL 1XPCR buffer，2.0yU^度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15yU^度为5U/yL的Taq酶，lOymol/L的引物ESF和ESR各0.5yL，DNA模板lyL，加ddH20至总体积达25yL;PCR反应条件为:94°C 预变性 5min;94°C 变性 45sec，55°C 退火 45sec，72°C 延伸 45sec，共 35 个循环；72°C 延伸lOmin； (3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5 X ??Ε缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm;根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出356bp的产物，则判定玉米叶片或叶鞘存在玉米大斑病菌。
【专利摘要】本发明涉及一种玉米大斑病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。该特异性引物包括上游引物ESF：5’-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3’，下游引物ESR：5’-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3’；采用上述引物经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳可在玉米大斑病菌纯DNA、带菌的玉米叶片或叶鞘中特异性地扩增出片段长度为356bp的特异性扩增产物。本发明检测引物特异性强、灵敏度高，检测方法实用性好，操作简便快捷；本发明能实现玉米大斑病的早期检测，还能有效区分玉米上的灰斑病、圆斑病和小斑病，对玉米大斑病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。
【IPC分类】C12R1/645, C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105648106
【申请号】
【发明人】石妞妞, 杜宜新, 阮宏椿, 陈福如, 杨秀娟, 甘林
【申请人】福建省农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月14日