检测疫苗中mdck细胞dna残留的试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种微量DNA检测方法，具体涉及一种检测疫苗中MDCK细胞的方法。
【背景技术】
[0002] MDCK细胞是一种狗肾(ATCC-CCL34)细胞系的传代细胞，具有许多优点：病毒感染 效率高、增殖快，且不易变异，MDCK细胞系(MDCK Cell Lines)被公认为最适于甲、乙型流感 病毒疫苗生产的3种细胞系之一。然而，用传代细胞株生产疫苗的一个重要问题是其安全 性，表现为具潜在致瘤性的残留细胞DNA。因此WHO对精制疫苗中残留的DNA有严格限制，如 WHO规定精制MDCK细胞流感疫苗中残余DNA含量不超过10ng/剂量(相当于10ng/ml)。残余 MDCK细胞DNA含量是基于MDCK细胞生产的精制疫苗的主要质量控制指标之一，必须进行严 格检定并纯化，使含量不能高于规定标准。
[0003] 由于DNA残留含量非常低，需要采用较敏感的核酸杂交技术。而目前用于检测疫苗 残留DNA的方法主要是分子杂交法，如利用随机引物法，用地高辛标记MDCK细胞DNA，并制备 成DNA探针，以此探针与待测样品总DNA以及已知浓度的参比样品DNA在硝酸纤维膜上进行 点杂交，最后通过显色信号强度来判断样品中DNA含量。
[0004] 与分子杂交法相比，taqman PCR技术应用于定量检测中具有如下优点：通过对扩 增曲线以及对数增长期的循环阈值(ct)的分析，摒弃分子杂交法受多种因素干扰的终点分 析法，能够对待测样品进行准确定量分析，从而有效监测疫苗纯化的效果;将DNA扩增与检 测过程融为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了分子杂交后处理过程，大大 缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷，方便；由于在普通PCR基础上增加了一条可与 模板互补配对的荧光探针，有效结合了 PCR和探针杂交的双重特异性，进一步提高了检测目 标靶多核苷酸的特异性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性与定量检测MDCK细胞DNA 的试剂盒，特别是本试剂盒可用于检测疫苗样品中MDCK细胞残留DNA，从而对疫苗生产过程 中进行质量监测。
[0006] 本试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸特异性引物和一条靶多核苷酸特异 性探针，在含有耐热DNA聚合酶，dNTPs，含镁离子缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现靶多核 苷酸的循环扩增，从而达到快速，定量检测靶多核苷酸的目的。
[0007] 本发明的一个方面提供了一种试剂盒，其特征在于，包括引物组;所述引物组包括 具有如SEQ ID No. 1所示的上游引物和具有如SEQ ID No.2所示的下游引物。
[0008] 进一步地，还包括如SEQ ID No.3所示的探针。
[0009] 进一步地，引物浓度为 0 · 2-0 · 3μπιο1/1，探针浓度为 0 · 40-0 · 60μπιο1/1。
[0010]进一步地，还包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶中的一种或两 者以上的混合物。
[0011] 本发明的另一个方面提供了上述的试剂盒在检测MDCK细胞DNA残留的应用。
[0012] 进一步地，所述MDCK细胞DNA残留为疫苗中的MDCK细胞DNA残留。
[0013] 本发明的再一个方面非诊断和非治疗目的的、基于上述试剂盒的检测MDCK细胞 DNA残留的方法，其特征在于，取待测样品经预处理后，提取核酸，扩增，判断是否具有DNA残 留。
[0014]进一步地，所述样品为疫苗。
[0015] 进一步地，扩增的反应温度和时间为:95 °C预变性30s;然后95 °C 5s，60 °C 34s，40个 循环。
【附图说明】
[0016] 图1为参考品扩增曲线，E = 99.5%;
[0017] 图2为MDCK细胞DNA参考品标准曲线。
【具体实施方式】
[0018] 主要材料：
[0019] MDCK细胞从ATCC(美国标准菌种保藏中心）引进，MDCK CCL-34，P55，Lot: 59681577;QPCR MIX购自日本takara公司；DNAiso购自本takara公司。
[0020] 实施例1MDCK细胞DNA参考品的制备
[0021]以MDCK基因组DNA作为阳性参考品；以猴肾细胞系Vero，中国仓鼠卵巢CH0，流感病 毒、DMEM培养基、PBS、FBS作为阴性参考品。采用Takara抽提试剂盒提取上述阳性参考品与 阴性参考品的DNA待用。
[0022] 实施例2特异性引物及探针的筛选
[0023]通过对Genbank数据库已有的狗肾全部核酸序列以及国内外已发表文献中报导的 核酸序列比对分析，以与MDCK细胞有关的主要基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度 保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针，高度重 复保守的靶基因序列与特异性探针为核心。
[0024] 以上述设计的多组引物探针分别检测上述阳性参考品与阴性参考品的基因组 DNA，经反复实验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合，如下所示：
[0025] 上游引物为GAGACATAGGCAGAGGGAGAAG SEQ ID N0.1;
[0026] 下游引物为GATCCTGGAGACCTGGGAT SEQ ID N0.2;
[0027] 探针为5FAM-CAGGCTCCATGCACCAGGAGC-3TAMRA SEQ ID N0.3。
[0028] 实施例3引物探针浓度的优化
[0029]在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0·15μπι〇1/1至0·5μπι〇1/1浓度 梯度的引物和从〇. 075μπι〇1/1至0.5μπι〇1/1浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验， 最终确定最佳的引物浓度为〇. 2-0.3μπι〇1/1，探针浓度为0.40-0.60μπι〇1/1。
[0030] 实施例4反应温度的优化
[0031] 根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸的时间进行了优化， 经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为:95°预变性30s;然后95° 5S，60° 34s， 40个循环。
[0032] 实施例5灵敏度实验
[0033] 提取阳性参考品提取阳性参考品MDCK细胞的DNA，经紫外分光光度计测定0D260和 0D280数值，计算出原液浓度为493.6pg/ml，稀释成浓度为10pg/ml，然后10倍梯度稀释成 1.0X100-1.0xl(T 6，ngAil作为阳性灵敏度参考品，根据检测疫苗样品的下限，使用浓度为 lOtK^ngAil，检测结果表明，本试剂盒的下