的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示，具体为：
[0058] CACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCTCCATGCATTTGGTATTTTCGTCTGGGGGGTGTGCACGCGATAGCATTGC GAGACGCTGGAGCCGGAGCACCCTATGTCGCAGTATCTGTCTTTGATTCCTGCCTCATCCTATTATTTATCGCACCT ACGTTCAATATTACAGGCGAACATACTTACTAAAGTGTGTTAATTAATTAATGCTTGTAGGACATAATAATAACAAT TGATGTCTGCACAGCCGCTTTCCACACAGACAT〇
[0059] 取1 X 107copy/ml的炭疽杆菌pagA质粒作为阳性对照品，分为5份，分别按1:1、1: 10、1:100、1:1000、1:10000的比例用ddH2〇做梯度稀释，最终获得待检阳性对照样品PA-1、 PA_2、PA_3、PA_4、PA_5，浓度分别为 1 X 107copy/ml、1 X 106copy/ml、1 X 105copy/ml、1 X 104copy/ml、1X103copy/ml。
[0060] 2. PCR扩增反应
[0061] 同样的，取人线粒体基因质粒作为阳性对照品，分为5份，分别按1:1、1:10、1:100、 1:1000、1:10000的比例用ddH2〇做梯度稀释，最终获得待检阳性对照样品MT-1、MT-2、MT-3、 MT_4、MT_5，浓度分别为 1 X 107copy/ml、1 X 106copy/ml、1 X 105copy/ml、1 X 104copy/ml、1 X103copy/ml〇
[0062] 首先，配置多重荧光PCR检测混合液，具体组成成分及含量可如下表2所示：
[0063] 表 2
[0064]
[0065]~然后，配制PCR反应体系，如下表3所示：^ '
[0066] 表 3
[0067]
[0068] 此次灵敏度检测共设5个浓度梯度，对应上述待检阳性对照样品PA-1、PA-2、PA_3、 卩八-4、卩厶-5、]\〇'-1、]?1'-2、]?1'-3、]\〇'-4、]?1'-5，加阴性对照((1(1!120)-管，共进行11个?〇?反应。配 置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液11 X 18ul，Taq DNA聚合酶+UNG酶11 X 0.4u 1，ddH20 11 X 2.6u 1，振荡混匀并瞬时离心后取混合液21 ul分置于11个PCR反应管中。 然后向1~5号管中分别加入4ul浓度依次为浓度分别为1 X 107copy/ml、1 X 106copy/ml、1 X 105copy/ml、1 X 104copy/ml、1 X 103copy/ml 的待检阳性对照样品PA-1、PA-2、PA-3、PA_4、 PA-5,再向6~10号管中分别加入4ul浓度依次为浓度分别为lX107C〇py/ml、lX106c 〇py/ ml、l X 105copy/ml、l X 104copy/ml、l X 103copy/ml的待检阳性对照样品MT-1、MT-2、MT_3、 MT-4、MT-5，最后向11号管中加入4ul ddH20作为阴性对照。
[0069] 3 .PCR 反应
[0070] 此次PCR反应在SLAN-965 Real-Time荧光PCR仪上进行，按说明书中推荐的参数将 反应条件设置为： (15 94^0 2 min (2) 94°C 2 min
[0071] (3) 93°C .5see: (4) 60°C 30 sec (进行单点荧光检测）
[0072] 步骤(3)-(4)循环 40 次。
[0073] 4.结果分析
[0074]不同浓度待检阳性对照样品炭疽杆菌pagA质粒检测结果如图1所示。
[0075]各样品的CT值如下表4所示：
[0076] 表 4
[0077]
LUU/SJ 该买验结采表明：小冋浓度的符粒阳性对照样品PA-1~PA-5在灾元粒测迓捏中均 为阳性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到lX103c〇py/ml。线性检测范围在1 X 104copy/ml ~1 X 108copy/ml。
[0079] 不同浓度待检阳性对照样品人线粒体基因质粒检测结果如图2所示。
[0080] 各样品的CT值如下表5所示：
[0081] 表 5
[0082]
L0083」该买验结果表明：+问浓度的待检阳性对照样品MT-1~MT-5在荧光检测过程中均 为阳性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到lX103c〇py/ml。线性检测范围在1 X 104copy/ml ~1 X 108copy/ml。
[0084]实施例3试剂盒检测效果评价 [0085]实验方法：
[0086] 1.样本处理：
[0087] 所用样本包括:购买的炭疽杆菌Π 号菌株(疫苗株），炭疽病牛组织样本，健康人血 清样本。
[0088]上述组织和血清样本按一下方法进行DNA提取，具体为：
[0089]所购买菌株的DNA提取方法按常规实验室提取细菌DNA的方法进行，具体为：细菌 用0.5ml生理盐水重悬，悬液经沸水浴20min后13 OOOrpm离心15min，取上清用于PCR反应。 记为1号样品。
[0090] 组织样本预先剪碎，放入含有0.5ml生理盐水的离心管中，振荡混匀，13 OOOrpm离 心2 m i η;去尽上清，沉淀中直接加入10 0 u 1试剂盒中提供的核酸提取液，沸水浴10 m i η; 13 OOOrpm离心5min，取上清用于PCR反应。记为2号样本。
[0091]健康人血清样本直接取50ul加入50ul试剂盒中提供的核酸提取液，充分混匀，沸 水浴lOmin; 13 OOOrpm离心5min，取上清用于PCR反应。记为3号样本。
[0092] 2.配制PCR反应体系，如下表6所示：
[0093] 表 6
[0094]
[0095]
[0096] 此次选取不同类型的样本共3个，加阴性对照/阳性对照反应各一，共需进行6管 PCR反应。配置过程中在一总管中加入多重荧光PCR检测混合液6X18ul，Taq DNA聚合酶+ UNG酶6 X 0.4ul，ddH20 6 X 2.6ul，振荡混匀并瞬时离心后取混合液21ul分置于6个PCR反应 管中，最后向1~3号反应管中分别加入4ul 1~3号样品，4号管中加入4ul lX107copy/ml 阳性对照样品炭疽杆菌pagA质粒，5号管中加入4ul 1 X 107copy/ml阳性对照样品人线粒体 基因质粒，6号反应管中加入4ul ddH20作为阴性对照。加样完成后迅速盖好管盖，进行PCR 扩增反应。
[0097] 3.PCR 扩增
[0098] 此次PCR反应在SLAN-965 Real-Time荧光PCR仪上进行，按上述推荐的参数将反应 条件设置为： (1) 94 C 2 nun (2) 94'C 2 min
[0099] (3) m V 5 see (4) 6:0^ 30 sec (进行单点焚光检测）
[0100] 步骤(3)-(4)循环 40 次。
[0101]阈值设定原则为:阈值线刚好超过阴性对照(ddH20)的最高点。
[0102] 4.结果分析：
[0103]各样本的扩增曲线如图3所示。
[0104] 实验结果如下表7所示：
[0105] 表7
[0106]
[0107] 实验结果表明，样品1，2检测结果为炭疽杆菌阳性，人线粒体基因阴性;样本3检测 结果为炭疽杆菌阴性，人线粒体基因阳性；阳性对照品扩增正常，阴性对照品无荧光信号， 说明此次实验扩增效果正常，无污染。所有阳性结果均经过Sanger测序法验证无误，可见本 试剂盒的检测结果具有很好的特异性和准确度。本发明提供的试剂盒检测结果稳定可靠， 阳性率及正确率高达100%，可以用于样本的直接检测。
[0108] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒，所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检 测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述炭疽杆菌基因检测引物包括核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，炭疽杆菌 基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述人线粒体基因检测引物包括核苷酸 序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物，所述人 线粒体基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述炭疽杆菌基因检测探针和人 线粒体基因检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌基因检测探针和人线 粒体基因检测探针的5 '端标记有荧光报告基团，3 '端标记有荧光淬灭基团。3. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述炭疽杆菌基因检测探针5 '端标 记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。4. 根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述人线粒体基因检测探针5 '端标 记的荧光报告基团为CY5荧光基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。5. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有dNTP、MgCl2、PCR 缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水中的一种或多种。6. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性对照或阴性 对照中的一种或多种。7. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有炭疽杆菌特异 性扩增片段的质粒或含有人线粒体基因特异性扩增片段的质粒。8. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，阴性对照为PCR反应缓冲液、无菌水 或生理盐水。9. 如权利要求1~8任一权利要求所述的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤： (1) 提取样品基因组DNA; (2) 加样:将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管 中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有如权利要 求1~4任一权利要求中PCR检测引物及探针； (3) PCR反应:反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应； (4) PCR反应结束后，分析结果。10. 如权利要求1~8任一权利要求所述的检测试剂盒在制备炭疽杆菌检测产品中的用 途。
【专利摘要】本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。本发明所述试剂盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述试剂盒检测灵敏度高，最低检出限为1×103copy/ml，准确率及阳性率均高达100%。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04, C12R1/07
【公开号】CN105648095
【申请号】
【发明人】黄吉城, 李小波, 郑夔, 师永霞, 刘燕, 王宁, 王凯
【申请人】广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 上海之江生物科技股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月18日