基于单分子靶向测序技术检测egfr/kras/braf基因突变位点的探针、方法、试剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于单分子靶向测序技术检测 EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的探针、方法、试剂及其应用，以及一种无创检测基因突变位 点的方法。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR)是位于7号染色 体短臂上的原癌基因 C-erbB-l(HER-l)的表达产物，是表皮生长因子受体家族(HER)中的4 个成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR酪氨酸激酶区域的突变 主要发生在18~21号外显子，其中19和21号外显子突变占总突变的90% AGFR信号传导的 异常是导致多种肿瘤发生的原因。研究表明，EGFR在多种肿瘤中都有表达，如结直肠癌、乳 腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等。
[0003] K-ras基因是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体短臂上，是ras基因家族成 员之一，编码KRAS蛋白。K-ras基因常见的突变位点位于2号外显子的12号密码子和13号密 码子上、3号外显子的61号密码子，其中有7个突变热点:G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、 G13V/D，占 K-ras基因总突变的98%以上。研究表明体细胞K-ras基因突变与多种人类恶性 肿瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、胰腺癌、结直肠癌有关，而生殖细胞K-ras基因突变与努 南综合征和心脏-面部-皮肤(cardi〇-facio_cutaneous，CFC)综合征相关。
[0004] BRAF基因是一种原癌基因，定位于7号染色体上，编码丝/苏氨酸特异性激酶。约 90%的BRAF基因突变发生在外显子15的1799位核苷酸上，T突变为A，导致缬氨酸被谷氨酸 取代(V600E)』RAF基因突变在黑色素瘤、结直肠癌、神经胶质瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌以及 肺癌等肿瘤细胞系中的发生率依次为59%、18%、11%、9%、14%、2%、3%;此外，81^? V600E在甲状腺乳头状癌中的发生率高达35.8% ARAF基因突变是晚期及复发性结直肠癌 最重要的预后指标之一，与患者较差的总体生存期密切相关。
[0005] 目前常见的检测这三个基因突变的方法有Sanger测序法和荧光定量PCR法。 Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，但对多个基因、或同一基因的不同外显子上的 突变位点就需分别进行扩增测序，操作繁琐，并且灵敏度较低约20%，假阴性率较高。荧光 定量PCR法虽然灵敏度高，但每对引物只能检测一种突变，且每种突变需单独建立一个PCR 反应体系，同时检测多个样本多个突变位点操作繁琐。这两种方法对样本的需要量都较大， 不适合同时检测多个基因突变位点。
[0006] 高通量测序法(NGS)虽然灵敏度高，同时可检测多个突变位点，但其建库流程复 杂，操作繁琐，时间长，成本高。
【发明内容】
[0007] 鉴于此，本发明提供了一种基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突 变位点的探针、方法和应用。本发明还提供了一种用于单分子靶向测序的样品的制备方法。
[0008] 第一方面，本发明提供了 一种基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因 突变位点的探针，包括检测EGFR、KRAS和BRAF基因中一个或多个基因的突变位点的一条或 多条探针，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示序列中的一条或多 条。
[0009] 具体地，如SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示探针如下表1所示。
[0010]表1·SEQIDN0:1~SEQIDN0:16所示探针
[0011]
[0012] 具体地，具有SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2所示序列的探针用于检测EGFR基因的外 显子18区域的突变位点；具体地，具有SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4所示序列的探针用于检测 EGFR基因的外显子19区域的突变位点；具体地，具有SEQ ID N0:5~SEQ ID N0:8所示序列 的探针用于检测EGFR基因的外显子20区域的突变位点；具体地，具有SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10所示序列的探针用于检测EGFR基因的外显子21区域的突变位点；具体地，具有SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12所示序列的探针用于检测KRAS基因的外显子2区域的突变位点；具体 地，具有SEQ ID NO: 13、SEQ ID N0:14所示序列的探针用于检测KRAS基因的外显子3区域的 突变位点；具体地，具有SEQ ID N0:15、SEQ ID勵：16所示序列的探针用于检测81^?基因的 外显子15区域的突变位点。
[0013] 在本发明一实施例中，所述SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16任一所示序列的5'端连 接有-(CH2)n-p〇ly(T)m-、-p 〇ly(T)m-或 _(CH2)n_，其中，n、m为自然数。
[0014]优选地，η为6-10的自然数。
[0015] 优选地逆为10-30的自然数。
[0016] 优选地，n、m均为10。
[0017] 在本发明一实施例中，所述的多条探针检测EGFR、KRAS和BRAF基因中任意两个或 三个基因的突变位点；其中，所述EGFR基因的突变位点位于:EGFR基因的外显子18~外显子 21区域中的至少一个;所述KRAS基因的突变位点位于:KRAS基因的外显子2~外显子3区域 中的至少一个;所述BRAF基因的突变位点位于:BRAF基因的外显子15区域。
[0018] 优选地，所述多条探针为SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:16所示的核苷酸序列组成的 探针组。
[0019] 本领域技术人员可以理解的，若摸索的检测探针（比如，SEQ ID N0:1~SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列组成的探针组)获得了较佳的杂交效果，一般情况下，设计探针的 时候，适当的将探针组中任一一条探针序列的长度延长或截短〇~3个碱基，也可以获得不 错的检测效果，也应纳入本发明保护范围。
[0020]第二方面，本发明提供了一种用于单分子靶向测序的样品的制备方法，包括:通过 封阻反应在待测DNA片段的3 '端修饰双脱氧核糖核酸，获得3 '端修饰有双脱氧核糖核酸的 待测DNA片段;其中，封阻反应中，脱氧核糖核酸与待修饰的DNA片段的摩尔比为1: 25~1: 200 〇
[0021]在本发明一实施例中，所述的在待测DNA片段选自PCR产物、片段化的基因组DNA或 经纯化的血液中的游离DNA。
[0022] 在本发明一实施例中，所述的PCR产物为采用多重PCR引物扩增待测样品所得的多 重PCR产物，其中，所述的多重PCR引物为引物组，所述引物组中各引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:17~SEQ ID N0:30所示。
[0023] 在本发明一实施例中，所述的双脱氧核糖核酸修饰有光学检测标记。
[0024]可以理解的是，本领域技术人员可以采用任一常规的方法在待测DNA片段的上修 饰双脱氧核糖核酸；比如，可参照二代高通量测序文库构建方法中加 A的方法进行DNA片段 的封阻;相比之下，本发明后续实施例中采用的封阻方法更佳，因为即便是对于对片段化的 基因组进行封阻，本发明后续实施例中采用的封阻方法也不需要进行末端补平即可直接进 行封阻反应，操作非常简便。更优选地，可采用Terminal Transferase Kit(NEB，M0315L)或 等同的试剂体系进行封阻反应。更进一步地，本申请人对该商用试剂盒的封阻反应条件进 行多次优化，摸索出较佳的对DNA片段的3 '端修饰双脱氧核糖核酸的封阻反应条件，当脱氧 核糖核酸与待修饰的DNA片段的摩尔比为1:100时，封阻效率可达到98%以上；而即使在该 摩尔比为1:25~1:200时，封阻效率仍然可达到70%~9%以上。
[0025]相比现有二代测序文库的制备，本发明第二方面提供了的用于单分子靶向测序的 样品的制备方法所获得的3'端修饰有双脱氧核糖核酸的待测DNA片段，可直接用于单分子 靶向测序，与5'端连接到基底表面的靶向引物进行杂交，进行测序反应;而不需要进行添加 测序接头(adaptor)等步骤，极大简化了测序样品文库的制备步骤。
[0026] 第三方面，本发明提供了 一种基于单分子靶向测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因 突变位点的方法，包括如下步骤：
[0027] (i)将靶向引物的5'端连接到基底表面;其中，所述的靶向引物为本发明第一方面 所述的探针；
[0028] (ii)提供或制备待测模板核酸，其中，所述的待测模板核酸的3'端修饰有带光学 检测标记的双脱氧核糖核酸;将所述待测模板核酸与所述步骤(i )中连接到基底表面上的 靶向引物进行杂交，形成杂交的靶向引物/模板核酸复合物；
[0029] (i i i)对所述靶向引物/模板核酸复合物进行成像；
[0030] (iv)将所述靶向引物/模板核酸复合物、聚合酶以及一种或多种带光学检测标记 的核苷酸混合，通过聚合酶反应将一种或多种带光学检测标记的核苷酸添加至靶向引物链 的3'端;获得延伸产物;其中，所述带光学检测标记的核苷酸还具有可断裂的基团；
[0031] (V)对延伸后的靶向引物/模板核酸复合物进行成像，并结合步骤（iii)中靶向引 物/模板核酸复合物的定位结果，进行图像比对和纠偏，以鉴定模板核酸上的待测核苷酸序 列；
[0032] (vi)除去延伸产物上带光学检测标记的核苷酸的可断裂的基团：
[0033] (vi i)重复步骤(iii)至(vi)-次或多次以鉴定所述模板核酸中的1个或多个核苷 酸。
[0034] 本发明通过延伸反应、成像检测和切除光学检测标记分子的反复循环，实现单分 子靶向测序技术(SMTS)实时测序。
[0035]如本发明所述的，所述的"待测DNA片段"与"待测模板核酸"可以互换。
[0036]可以理解的是，可采用本领域常规的探针固定方法将本发明第一方面的探针序列 (即所述步骤(i)中的靶向引物)的5'端连接到基底表面。但申请人在研究过程中发现，不同