[0037] 利用Gramene网站上（http : //www · gramene · org)提供的微卫星序列搜索工具 SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool)找出BAC序列中的微卫星序列，然 后用Primer Premier 5.0对微卫星的侧翼序列自动或人工设计出扩增长度为200-1000bp 左右的上下游引物对，并进行筛选出3对SSR标记，然后由生工生物工程(上海)股份有限公 司合成。
[0038] 2.2水稻55財示记在水稻株高基因？!1-1(〇精确定位中的应用
[0039] 通过已公布的SSR标记进行多态筛选，将控制水稻高杆基因定位于水稻第1染色体 短长臂PSM331和RM1068两个标记之间的区域(图1，图2)，【具体实施方式】如下：
[0040] 根据已公布的SSR标记（如表1所示）进行多态筛选，发现RM315，PSM331，PSM423， RM104，RM529共5个SSR标记在两亲本之间均有多态。
[0041]根据分子标记分析的结果，利用MAPMAKER(EXP3.0b)软件进行分子数据的分析，并 计算标记间的遗传距离。株高基因 PH-l(t)被定位在第1染色体上，位于长臂一侧的微卫星 标记RM1068、PSM423、RM104与PH-1 (t)的遗传距离分别为为0 · 5cM、0 · 9cM、8 · 9cM，位于另一 侧的微卫星标记卩3]\031、1?1472、1?015与?!1-1(〇的遗传距离分别为1.(^]\1、3.7〇]\1、6.4〇]\1(图 3) 〇
[0042]表1单片段代换系上SSR标记
[0043]
[0044] 为了进一步定位目标基因，根据PSM331和RM1068之间已公布的SSR标记，选取10对 (如表2所示)对重组株进行扩增，其中1?111964，1?111966，1?111977在两亲本间具有多态，用 这3对标记对PSM331和RM1068之间的重组株进行扩增，对其基因型和表现型进行分析，将高 杆基因 PH-l(t)定位于RM11977和RM1068之间，物理距离为68kb。
[0045] 表2 PSM331 和RM1068之间的SSR标记
[0046]
[0047] 为了进一步精确定位目标基因，根据已知的水稻全基因组序列，在水稻第1染色体 上RM11977和RM1068之间的BAC序列上寻找微卫星序列，共设计了 10对新的SSR标记，用这10 对SSR标记检测引物对亲本进行扩增，从10对SSR标记中筛选出3对，均具有多态性(图4)。分 别命名为SSR分子标记L06、SSR分子标记L08、SSR分子标记L10。通过进一步对RM11977和 RM1068之间剩余重组株进行分析。分析发现1株高杆植株，1株半矮杆植株显示目标基因在 SSR分子标记L06的上游，而3株高杆植株则显示目标基因在引物RM11977的下游。由此最终 将基因 PH-l(t)定位于RM11977和L06之间，物理距离为23kb。
[0048] SSR分子标记L06的上游标记核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游标记核苷酸序 列如SEQIDN0.2所示；SSR分子标记L08的上游标记核苷酸序列如SEQIDN0.3所示，下游 标记核苷酸序列如SEQIDN0.4所示 ；SSR分子标记L10的上游标记核苷酸序列如SEQID N0.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示(如表3所示）。
[0049] 表3 RM11977和RM1068之间新的SSR标记
[0050]
[0051]
[0052] 实施例2水稻SSR分子标记L06、SSR分子标记L08、SSR分子标记L10的应用
[0053] 2.1水稻基因组DNA提取
[0054] 采用改良TPS简易法提取水稻基因组总DNA，具体步骤如下：
[0055] 1、在分蘖盛期每个单株取上部1~2片幼叶，保存与_80°C冰箱中备用；
[0056] 2、抽提DNA时取2~4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加 TPS 抽提液900ml，75 °C水浴30~60min;
[0057] 3、12000rpm离心1 Omin，吸取上清约500ml转入新1 · 5ml离心管；
[0058] 4、加入预冷异丙醇或无水乙醇加满。4°C过夜，12000rpm离心10min;
[0059] 5、弃上清，干燥沉淀，加150μ1灭菌水，4°C备用。
[0060] 所述TPS抽提液组分如下：100mM Tris-HCL(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)、lM KCL。
[0061] 2.2PCR 扩增
[0062] PCR扩增在PE9700型热循环仪中进行。20μ1反应体系组分如下：
[0063] 2XHifi PCR Mix 10μ1，50~lOOng的DNA模板ΙμL，正向引物ΙμL，反向引物ΙμL， ddH20 7μ1，总反应体系为20μ1。
[0064] 引物分别为SSR分子标记检测引物L06、SSR分子标记检测引物L08、SSR分子标记检 测引物L10。
[0065] PCR反应程序为：
[0066] 94°C 预变性 5min;94°C 变性 lmin，55°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin，35 个循环;72°C 延 伸5min〇
[0067] 2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及多态性检测
[0068] PCR产物用质量百分比为6%的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，基本操作包括以下三个 步骤：
[0069]制胶:称取9.6g尿素，加45ml蒸馏水和8ml 10 X TBE缓冲液，用玻棒搅拌使尿素完 全溶解，然后加入12ml 40%丙烯酰胺溶液，搅匀，加入0.8ml 10%过硫酸胺和35μ1 TEMED， 搅匀后立即倒入已用琼脂糖凝胶封口的玻璃板中，灌满后放平，使其与桌面成10°左右的倾 角。插入梳子，静置1~2h使胶凝固。
[0070] 上述10 XTBE缓冲液组分如下：
[0071] 108g Tris-HCl、55g硼酸、7.44g EDTA加蒸馏水溶解，定容至 1000ml;
[0072] 上述40wt %丙烯酰胺溶液组分如下：
[0073] 38g丙烯酰胺、2g N，N'_亚甲基双丙烯酰胺，加水定容至100ml;
[0074]点样:待胶完全凝固后，小心拔出梳子，尽量保持点样孔完整。将玻璃板固定在垂 直电泳槽上，加入适量的1 X TBE电泳缓冲液;取电泳缓冲液反复冲洗点样孔，清除多余没有 凝固的物质;取PCR扩增产物，每管PCR产物中加入4μ1载样缓冲液，混匀后用微量进样器(购 自上海医用激光仪器厂)取3~4μ1注入点样孔。
[0075]上述载样缓冲液组分如下，均为重量百分比：
[0076] 0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、50%甘油，余量水。
[0077] 电泳：调电压至250V，电泳时间约3~4h。
[0078]电泳完毕后，将玻璃板从电泳槽上拆下，取出凝胶，在蒸馏水中漂洗两次;转移至 0. lwt%AgN03溶液中染色，在摇床上轻摇lOmin;然后将凝胶转移至蒸馏水中漂洗两次；最 后转入显色液中显色，着色后转入自来水中保存，记录带型结果或凝胶成像。
[0079] 显色液组分如下：
[0080] 6g氢氧化钠、0 · 076g四硼酸钠、1 · 6ml甲醛，加水定容至400ml。
[0081 ] 由上述实验结果（图1~4)可以看出，水稻SSR标记PSM331，RM1068，L06，L08和L10 的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，利用本发明设计的SSR分子标记L06、 SSR分子标记L08、SSR分子标记L10对F2次级分离群体进行扩增将该显性株高基因定位于水 稻第1染色体长臂RM1068和L06之间，物理距离为23kb。采用SSR标记并通过水稻基因组注释 系统(RiceGAAS)对RM1068和L06之间23kb的染色体区域进行了基因预测及功能分析，在这 区域内发现含有5个ORF，其中0RF3与赤霉素的合成有关，初步推测其为目标基因 PH-l(t) (图5)。利用本发明设计的SSR分子标记引物对水稻高杆基因进行遗传分析和精细定位，同 时也可用于水稻构建高密度遗传图谱和品种指纹图谱。
【主权项】
1. 与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06，该分子标记为一对，上游标记核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 权利要求1所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06在构建水稻第1染色体高 密度遗传图谱和品种指纹图谱中的应用。3. 权利要求1所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06在水稻第1染色体高杆基 因遗传分析和精细定位中的应用。4. 与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08，该分子标记为一对，上游标记核苷酸序 列如SEQ ID NO.3所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。5. 权利要求4所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08在构建水稻第1染色体高 密度遗传图谱和品种指纹图谱中的应用。6. 权利要求4所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08在水稻第1染色体高杆基 因遗传分析和精细定位中的应用。7. 与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10，该分子标记为一对，上游标记核苷酸序 列如SEQ ID NO.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。8. 权利要求7所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在构建水稻第1染色体高 密度遗传图谱和品种指纹图谱中的应用。9. 权利要求7所述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在水稻第1染色体高杆基 因遗传分析和精细定位中的应用。
【专利摘要】本发明涉及与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记与应用。与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06，上游标记核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。以及与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08和与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10。本发明首次筛选出了3对与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06、SSR分子标记L08、SSR分子标记L10。上述3对SSR标记能够将水稻第1染色体高杆基因进行遗传分析和精细定位，可用于构建水稻高密度遗传图谱和品种指纹图谱。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105648064
【申请号】
【发明人】姚方印, 陈高, 张华 , 柳絮, 宣宁, 杨永义
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月4日