一种高灵敏度反向斑点杂交方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种反向斑点杂交方法，特别涉及一种高灵敏度反向斑点杂交方法。
【背景技术】
[0002] 斑点杂交方法首先由Kafato等发展起来，用于在固相支持物上固定几种核酸样 品，然后用合适的探针与已固定的样品杂交，并由此判断靶序列的浓度。通过估计样品点发 射出的信号强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，该方法还可以进一步确定待测 样品中靶序列的量。应用斑点杂交方法检测序列变异时，若靶序列内存在突变，则其扩增产 物在严格的条件下无法与探针杂交，无杂交信号就表示目的基因存在突变。多年来，斑点杂 交并未受到研究者的青睐，原因之一在于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定。此 外，正向杂交须先将PCR扩增产物固定，再与探针进行杂交，这样就要对每个标本的扩增产 物进行固定，增加了操作步骤。
[0003] 反向斑点杂交则是由Saiki等提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种 特异性探针的固相支持物与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种 突变。这种以固相支持物上固定探针取代固定靶核酸的方式，改变了传统斑点杂交法一次 只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、重复性好以及信号稳定的特点，尤其在基因突 变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。
[0004] 现有的反向斑点杂交技术都是以硝酸纤维素膜或尼龙膜作为固相支持物，不仅易 于破碎，涉及的反应溶液和反应步骤众多，效率较低，而且检测待测样品中靶序列的灵敏度 不高，分辨能力较差，容易出现假阳性和假阴性，难以满足医院临床检测的需求。
[0005] 出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴 露出来的问题，期望提供一种特异性高、耗时短、易操作的高灵敏度反向斑点杂交方法及其 在检测K-ras基因突变中的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种反向斑点杂交方法。该方法通过在金属膜表面上 实现核酸杂交过程与碱性磷酸酶联过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱 性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物。本发明通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅 以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，极大提高了反 向斑点杂交的检测灵敏度与分辨能力。
[0007] 本发明的又一目的在于提供所述方法在检测K-ras基因突变中的应用。
[0008] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种高灵敏度反向斑点杂交方法，其包括 如下步骤：
[0009] A)将至少一种核酸探针固定在固相支持物负载的金属膜表面；
[0010] B)利用预处理液对所述金属膜表面进行预处理；
[0011] C)将所述核酸探针在包含碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液中与生物素标记 的靶核酸进行一步反应；
[0012] D)步骤C)中反应完成后，利用后处理液对所述金属膜表面进行后处理；
[0013] E)将包含底物的显色溶液与金属膜表面接触进行显色反应。
[0014] 本发明的方法在核酸探针与靶核酸杂交的过程中同步实现了碱性磷酸酶标记链 霉亲和素与生物素的结合过程，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交 体的偶联物，不仅省去了传统反向斑点杂交方法中在杂交反应后需要单独进行酶联反应的 步骤，缩短了传统反向斑点杂交方法操作的耗时，而且促进了核酸杂交，提高了碱性磷酸酶 标记效率，使得金属膜表面单位面积上覆盖的碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联物的数量 大大增加，再通过显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜的强烈色差，可以用肉 眼快速判断核酸杂交的结果，在同等条件下明显提高了传统核酸反向斑点杂交方法的检测 灵敏度与分辨能力。
[0015] 根据本发明的一个具体实施例，所述金属膜选自金膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银 膜和错膜，所述金属膜的厚度为l〇nm~100nm。
[0016] 金属是一种具有光泽的物质，其对可见光强烈反射。由于碱性磷酸酶催化底物可 产生化学显色反应，能够在金属膜表面产生颜色变化，从而可以通过肉眼直观、快速地观察 金属膜表面核酸杂交反应前后斑点颜色的深浅，以准确判断样品中含有的靶核酸情况。作 为本发明的一个优选实施例，所述的金属膜优选银膜或铝膜。纳米级的银膜或铝膜能够呈 现较好的反光性能，可以明显提高显色反应后检测靶核酸的分辨能力。此外，金属膜还结实 耐用，易于清洗，容易去除杂交背景。
[0017] 根据本发明的一个具体实施例，所述固相支持物选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅 片、载玻片或塑料片，优选塑料片，更优选环烯烃共聚物塑料片。
[0018] 环烯烃共聚物是一种由环烯烃与α -烯烃聚合而成的高附加值热塑性工程塑料， 具有很高的透明度。本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，环烯烃共聚物塑料 表面能够很好地与金属膜结合，不仅金属膜不容易从塑料表面脱落，而且反光性能非常好， 在其表面负载一层纳米厚度的金属膜后，碱性磷酸酶催化底物的显色反应效果更为明显， 可以进一步提高本发明中的方法检测靶核酸的灵敏度与分辨能力。
[0019] 根据本发明的一个优选实施例，负载有金属膜的固相支持物在使用前被真空封 装。
[0020] 在本发明的方法中，金属膜负载到固相支持物表面的方法以及核酸探针在金属膜 表面的固定方法均在本领域技术人员的知识范围内。作为一个优选的实施例，金属膜可以 通过真空镀膜的方法蒸镀到固相支持物表面，核酸探针可以通过末端连接的巯基基团与金 属膜实现固定连接。
[0021 ] 在本发明的方法中，所述碱性磷酸酶是一种同源二聚体蛋白，是一种含锌的金属 酶。每分子酶至少含2个Ζη原子。酶上包含3种类型的金属结合位点，即所谓的催化结合 位点、结构结合位点和调节结合位点。其中两个催化结合位点的结合则只会导致一个亚单 位的磷酸化，即负协作亚单位之间发生相互作用。
[0022] 在本发明的方法中，所述生物素有两个环状结构I和II。其中，I环为咪唑酮环， 是其与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C 2上有一戊酸侧链；生物素分子通过 其末端的羧基与本发明所述的靶核酸连接，从而标记在靶核酸分子上。
[0023] 在本发明的方法中，所述链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质，其分子由4 条相同的肽链组成，每条肽链都能结合一个生物素，因此每个链霉亲和素分子能结合4个 生物素分子。此外，每条肽链的氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，肽链中的色氨 酸残基是连接生物素的活性基团。所述链霉亲和素与生物素二者亲和结合的常数（K)为 1015L/mol。在本发明的方法中，靶核酸与核酸探针杂交的同时，链霉亲和素与生物素也进 行亲和结合，因此杂交液中的碱性磷酸酶标记链霉亲和素分子与固定在固相支持物表面的 核酸探针分子在一步反应中竞争性结合生物素标记的靶核酸分子。
[0024] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，本发明的方法将所述碱性磷酸 酶标记链霉亲和素直接加入到杂交液中，一方面能够使得碱性磷酸酶标记链霉亲和素与生 物素标记靶核酸充分的结合；另一方面还能够促进核酸杂交效率，缩短核酸杂交反应的时 间。
[0025] 根据本发明的一个具体实施例，步骤C)中所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂 交液中的浓度为〇· 05~2 μ g/ml，优选0· 1~1. 5 μ g/ml，更优选0· 5~1. 2 μ g/ml。在 本发明的方法中，可以列举的所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度包括但不 限于：〇· 05 μ g/ml、0. 06 μ g/ml、0. 07 μ g/ml、0. 08 μ g/ml、0. 09 μ g/ml、0. 1 μ g/ml、0. 2 μ g/ ml、0. 3μ g/ml、0. 4μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 6μ g/ml、0. 7 μ g/ml、0. 8μ g/ml、0. 9μ g/ml、 1 μ g/ml、L 1 μ g/ml、L 2 μ g/ml、L 5 μ g/ml 和 2 μ g/ml 〇
[0026] 在本发明的方法中，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂交液中的浓度是本发明 的重要方面。本发明的发明人经过大量试验与创造性劳动发现，如果碱性磷酸酶标记链霉 亲和素在杂交液中的浓度过低，那么影响靶核酸检测的灵敏度；如果碱性磷酸酶标记链霉 亲和素在杂交液中的浓度过高，那么容易带来非特异性吸附现象，影响靶核酸检测结果的 准确性。
[0027] 根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙 烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C 17~C19的脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构 醇选自Q。~C13异构醇。
[0028] 根据本发明的一个具体实施例，在所述预处理液中，胱胺为3~20重量份，脂肪醇 聚氧乙烯醚为2~18重量份以及异构醇为0. 2~9重量份；优选地,胱胺为5~10重量 份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3~12重量份以及异构醇为2~8重量份。
[0029] 本发明的发明人经过大量实验与创造性劳动发现，胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在预 处理液中协同配合作用，不仅能够有效封闭金属膜表面的非特异性活性位点，提高检测的 特异性，而且能够在金属膜表面形成一层保护层，有效防止使用中的金属膜表面被氧化。本 发明采用高碳原子数的异构醇，一方面可以提高胱胺的溶解性，使其获得较高的增容参数 与分子自组装活性能力，另一方面可以提高胱胺与脂肪醇聚氧乙烯醚在固相支持物表面的 吸附效果。
[0030] 根据本发明的一个具体实施例，步骤B)中所述预处理是将所述固相支持物浸泡 在25~37°C温度的所述预处理液中30~60min。
[0031] 预处理液的温度以及固相支持物在其中的浸泡时间直接影响胱胺与脂肪醇聚氧 乙烯醚在固相支持物表面的吸附效果。温度较低或浸泡时间较短，吸附效果较差；温度过高 或浸泡时间过长，不仅吸附在固相支持物表面的靶DNA构象变化，影响后期核酸杂交效率， 而且固相支持物表面负载的金属膜有可能会脱落。本发明的发明人通过大量试验与创造性 劳动发现，将所述固相支持物浸泡在25~37°C的所述预处理液中30~60min，预处理效果 较好。
[0032] 根据本发明的一个具体实施例，步骤C)中所述杂交液包括锌离子、镁离子、表面 活性剂和阳离子型