I双酶切pMD2.G质粒,回收酶切产物,收取119bp CMV片段; (1.2) 将pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen质粒用BamH I和Κρη I进行双酶切,回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen 片段; (1.3) 将回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA连接酶进行连接,连接成功后, 提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒; (1.4) 使用Ncol和Xbal双酶切PGL3_Promoter Vector,回收 1906bp Luciferase片段, pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒用Ncol和Xbal双酶切,回收4855bp的片段,将该片段和 Luciferase片段用T4DNA连接酶进行连接;连接成功后,提取的质粒即为pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen〇
[0021] (2)包装质粒的构建 所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒,其序列如序列如SEQIDNo.6所示,结构如图3所 不。
[0022]所述包装质粒的构建方法如下: (2 · 1)基于psPAX2的载体重建 定点突变改造载体psPAX2,以定向封闭多余的酶切位点AgeI与Apal。
[0023] 为使人源HIV-1耐药基因片段(Pol-HIV(partial)片段,简写为pol)克隆到包装质 粒psPAX2限制性酶切位点Age I和Apa I之间,需要通过PCR和基因定点突变修饰质粒另外 两位点的Age 1(7697位)和Apa 1(863位)。
[0024]在本发明中,该HIV-1耐药基因片段的提取方式如下: PCR扩增获得pol片段,其序列如SEQ ID No.5所示。
[0025] OUT-R:CCTTGCCCCT GCTTCTGTAT TTCTGC IN-F:TGCAGG GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG(Apal) IN-R:CACTCCATGT ACCGGTTCTT TTAGAATCTC(Agel) 模板为人体样本提取的RNA,第一轮反应条件:45°C逆转录30min,PCR 94°C预变性 2min,98°C变性10s,51°C退火15s,68°C延伸2min,循环30次;第二轮反应条件:98°C变性 10s,51°C 退火 15s,68°C 延伸 2min,循环 30 次。
[0026] (2.1.1)利用长引物法PCR突变包装质粒psPAX2酶切位点Agel (2.1.1.1) PCR扩增突变包装质粒psPAX2酶切位点Agel获得Agel-l片段,其序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0027] 引物:Age I-F: CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC(SacI) AgeI~R:CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG(Nhel) 加粗斜体T代表突变后的碱基,其原始碱基为C。模板为psPAX2(psPAX2为HIV-1野生株 假病毒骨架质粒,GenBank编号:D86068.1 )PCR条件:94 °C预变性4min,94 °C变性20s、55 °C退 火20s、72°C延伸lmin,循环35次,最后72°C延伸5min。
[0028] (2 · 1 · 1 · 2)回收突变后Agel-l片段,插入PZeroBack/Blunt Vector(北京天根公 司),形成T-AgeV质粒;将T-AgeF质粒进行鉴定测序,正确即点突变成功;用SacI与Nhel双 酶切T-AgeV质粒,即酶切突变成功的片段;将该酶切突变成功的片段连接至表达载体 psPAX2,连接成功后,提取的质粒命名为psPAX2-l,其序列如SEQIDNo.2所示。
[0029] (2.1.2)利用定点突变试剂盒突变载体psPAX2-l酶切位点Apal (2.1.2.1) 使用Agi 1 ent公司定点突变试剂盒对载体psPAX2-1进行定点突变,命名为 psPAX2-2,其序列如SEQIDNo·3所示。
[0030] 引物:M-Apal-F GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG M-Apal-R CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC 模板为 psPAX2-l,PCR 条件:95°C 预变性 2min,95°C 变性 30sec,55°C 退火 lmin,68°C 延伸 10min,循环18次。
[0031] (2· 1.2.2)DpnI酶切扩增产物psPAX2-2;将酶切产物转化XL 10-G0LD感受态细胞, 质粒提取,命名为PSPAX2-2'; Apal酶切质粒PSPAX2-2',挑取酶切鉴定正确的质粒,送英骏公司测序,并将测序结果 正确的质粒命名为psPAX2m,其序列如SEQIDNo.4所示。
[0032] (2.2)psPAX2m-pol 质粒构建 用Apal和Agel酶切pol片段回收并插入psPAX2m载体(psPAX2m用Apal和Agel切割),构 建为psPAX2m-pol质粒,用于重组慢病毒的生产。psPAX2m-pol质粒如图3所示,其序列如SEQ ID No .6所示。
[0033] (3)重组慢病毒的生产及其在不同细胞的应用 (3.1)将步骤(1)构建好的pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen转移质粒、步骤(2)构建好的 psPAX2m-pol包装质粒与pMD2.G包膜质粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体。本 发明采用293FT细胞。转染前36h,铺细胞,75cm 2细胞培养瓶,细胞总数为3 X 106个。当细胞汇 合度达75%时,将总量为15yg的三质粒(2.8yg包膜质粒pMD2.G,5.2yg包装质粒psPAX2-Pol 和7yg转移质粒pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen)和45μ1 X-tremeGENE HP DNA转染试剂 (尺〇吐6,1^4)一起置于1.5!111的0?^-1^1培养基中,室温静置151^11,共转染293?1'细胞。4811 后倒置荧光显微镜下质粒共转染情况,结果如图4所示,证明重组慢病毒载体改造前后,转 染特性未变。收集慢病毒上清,4°C 3000rpm离心20min,用0.45μπι滤器滤过,得到重组慢病 毒。
[0034] (3.2)重组慢病毒活性与滴度测定 病毒滴度测定按照Ngai,S. C.等标准,得到的样本假病毒原液10倍稀释后,用50ul稀释 后的病毒液感染十二孔板培养的293A细胞,60小时后,流式细胞仪检测每孔荧光百分比,计 算慢病毒活性滴度。结果如图6所示,证明重组慢载体改造前后,病毒感染性未变。
[0035] (3.3)本发明的重组慢病毒在293A细胞中的应用 因 psPAX2m中的pol基因来源于野生型的HIV-1,以psPAX2m,pMD2.G和pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen共转染293A细胞制备的重组慢病毒在表型耐药检测中作为野生型的HIV-1对 照病毒。为了评价HIV-1抑制药物是否影响病毒感染和蛋白生产,齐多夫定(D4T)作为抗病 毒药物代表,以优化检测条件。
[0036] (3.3.1 )HIV药物司他夫定敏感性与细胞数目相关实验 铺板96孔板293A细胞,分5组,每组分别为10000、15000、20000、25000、与30000个/孔, 当细胞汇合度达到80 %时,按照每孔细胞数目计算Μ0Ι = 10时所需要的病毒液体积。配制不 同药物浓度的司他夫定,将上述所需病毒液加至不同浓度的药物中,加入到96孔293A细胞 中。感染60小时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达情况。结果显示,细胞数目为1.5 X 104 细胞/孔时,药物浓度和焚光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的A图所示。
[0037] (3.3.2汨1¥药物司他夫定敏感性与病毒101相关实验 铺板96孔板293A细胞,每孔20000个细胞,共设置10个实验组,当细胞汇合度达到80 % 时,计数每个实验组孔中的细胞数目,按照每孔细胞数目计算当Μ0Ι分别为2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需病毒液 加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔293A细胞中。感染60小 时后,检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示,Μ0Ι为10时,药物浓度和荧光素酶的 活性相关性最佳。结果如图5中的B图所示。
[0038] (3.3.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验 铺板96孔板293A细胞,分4组,每组20000个/孔,当细胞汇合度达到80 %时,按照每孔细 胞数目计算M0I = 10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定,并将上述所需 病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液,加入到96孔293A细胞中。分 别于病毒感染36、48、60、72小时后,检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示,感染时间为60 小时时,药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图5中的C图所示。
[0039] (3.3.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性 通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。 根据上述3个实验,确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、Μ0Ι以及病毒感染时间。铺96孔 板,当细胞汇合度达到8