%，Κ2ΗΡ04 · Η20 0· 14%，pH 8. 5-9. 0。
[0046] 生物转化反应：将步骤二初筛得到的24株菌株接种到复筛培养基孔板，30°C培养 箱中静置培养24h，离心收集菌体，用生物转化液洗涤后再与0. 5mL生物转化液混合，混合 物30°C孵育24h，离心取上清分析生成的L-丙氨酸。
[0047] 3、纸层析半定量分析L-丙氨酸含量
[0048] 将上述反应液点样于新华3号滤纸上，同时点样0. 5% L-丙氨酸标准溶液作为阳 性对照。展开剂为正丁醇：冰醋酸：水=4:1:1，显色剂为0.5%茚三酮丙酮溶液。首先根 据阳性对照Rf值确定L-丙氨酸斑点位置，然后根据凝胶成像系统和图像分析软件分析斑 点的颜色深浅，进而确定菌株生物转化生成L-丙氨酸的能力。
[0049] 选取斑点最大颜色最深的一株菌进行摇瓶发酵试验，进一步确认酶活性。
[0050] 四、摇瓶发酵结合氧化显色法确认酶活性
[0051] 1、摇瓶发酵培养
[0052] 摇瓶发酵培养基配方：葡萄糖3%，蛋白胨1 %，酵母粉0. 2%，NaCl 1. 5%，ΚΗ2Ρ04 0. 05 % , K2HP04 · H20 0. 14 %, MgS04 · 7H20 0. 03 %, CaCl2 0. 05 %, pH 8. 5-9. 0 〇
[0053] 将摇瓶发酵培养基121°C灭菌20min，冷却后分装于1L三角瓶中，250mL/瓶。
[0054] 2、生物转化
[0055] 生物转化液：L-天冬氨酸 2%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，ρΗ8· 5-9. 0。
[0056] 生物转化反应：将步骤三复筛得到的高产菌株接种到摇瓶发酵培养基，30°C恒温 摇床培养24h，振荡速度转速150转/分钟。离心收集菌体，用生物转化液洗涤后再与50mL 生物转化液混合，30°C孵育24h，离心后取上清液氧化显色法测定酶活性。
[0057] 3、氧化显色法测定酶活性：
[0058] 参考《药物生物技术》1996, 3 (2) : 105-108 "氧化显色法测定L-天冬氨酸-β -脱 羧酶活力"，酶活单位定义为：采用所述文献操作方法，每克湿细胞每小时催化生成1微克 分子的L-丙氨酸为一个酶活力单位1U。最终测得本实施例的酶活为83. 5U。
[0059] 实施例2对实施例1所得L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌的菌种鉴定
[0060] 一、菌株形态及生理生化特征鉴定
[0061] 参照《常见细菌系统鉴定手册》的方法，对菌株进行菌株形态及生理生化特征鉴定
[0062] 1、菌体形态特征实施例1所得L-天冬氨酸β_脱羧酶产生菌为革兰氏阴性菌，细 胞呈短杆状，极端鞭毛，无芽孢；在肉汤琼脂平板上可形成扁平的圆形菌落，呈微黄色，表面 较粗糙，陈旧培养物有臭味。
[0063] 2、生理生化特征鉴定结果如表1所示。
[0064] 表1 L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌的生理生化特征
[0065]
[0066] 二、菌株16S rDNA序列分析
[0067] 将菌株在LB培养基中培养过夜后，用溶菌酶裂解法提取细菌总DNA，委托上海生 工生物工程技术服务有限公司进行16S rDNA测序。将测得16S rDNA序列与GenBank数据 库中相关种、属的序列比较，进而确定该菌株为恶臭假单孢菌（Pseudomonasputida)。
[0068] 实施例3对比例：生物转化生产L-丙氨酸的性能考察
[0069] 本对比例考察了试验菌株与对照菌株转化生产L-丙氨酸的性能差异。其中试 验菌株为实施例1筛选到的高产菌株对照菌株恶臭假单孢菌（Pseudomonas putida), 对照菌株Pseudomonas dacunhae购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号 1511C0005000003137,该菌株是L-丙氨酸的生产菌株。
[0070] 1、摇瓶发酵培养
[0071] 摇瓶发酵培养基配方：葡萄糖3%，蛋白胨1 %，酵母粉0. 2%，NaCl 1. 5%，ΚΗ2Ρ04 0· 05%，Κ2ΗΡ04 · H20 0· 14%，MgS04 · 7H20 0· 03%，CaCl2 0· 05%，pH 6· 5-7. 0。将摇瓶发 酵培养基121°C灭菌20min，冷却后分装于1L三角瓶中，250mL/瓶。然后将分装好的培养基 分别接种试验菌株与对照菌株，30°C恒温摇床培养24小时，振荡速度转速150转/分钟。
[0072] 2、生物转化反应
[0073] 向试验菌株发酵液与对照菌株发酵液中添加 10g L-天冬氨酸，30°C孵育72h，分 别在添加1-天冬氨酸1211、2411、4811、7211后取样，测定样品？!1值，并采用实施例1步骤四所 述氧化显色法测定酶活性。测定结果如表2所示。结果表明随着转化反应的进行，试验菌 株与对照菌株的发酵液pH值都不断上升，然而对照菌株的酶活性不断下降，转化72h后酶 活降至初始酶活的30%，而试验菌株的酶活比较稳定，转化72h后酶活仅降低14%，表现了 优异的耐碱性与稳定性。
[0074] 表2试验菌株与对照菌株酶活对照表 [00751
【主权项】
1. 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，包括如下步骤： 1) 采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离； 2) 将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养 基的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β -脱羧酶产生菌； 3) 将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层 析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β -脱羧酶高产菌株； 4) 将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧 化显色法测定L-天冬氨酸β -脱羧酶酶活性。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集培养基含有质量百分 含量 1% -2%的 NaCl ; 步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0. 05%的CaCl2 ; 步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛培养 基，20°C _37°C恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20°C _37°C孵育12-24 小时； 步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发酵 培养基，20°C -37°C恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20°C -37°C孵育 12-24小时。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述富集培养的方式 为：将微生物样品用富集培养基洗涤三次，然后接种到富集培养基，温度20°C -37°C、转 速100-200转/分钟振荡培养2-4天；所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏 〇· 5 %，蛋白胨 1 %，酵母粉 0· 2 %，ΚΗ2Ρ040 · 05 %，Κ2ΗΡ04 ·Η200· 14 %，NaCl 1. 5 %，ρΗ8· 5-9. 0。4. 根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述复筛培养 基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，NaCll. 5%， ΚΗ2Ρ040· 05%，Κ2ΗΡ04 · Η200· 14%，MgS04 · 7Η200· 03%，CaCl20. 05%，ρΗ8· 5-9. 0。5. 根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述摇瓶发酵培 养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0.2%，NaCll. 5%， ΚΗ2Ρ040· 05%，Κ2ΗΡ04 · Η200· 14%，MgS04 · 7Η200· 03%，CaCl20. 05%，ρΗ8· 5-9. 0。6. 根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于：步骤3)与步骤4)中，所述生物 转化液各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2%，ΚΗ 2Ρ040 . 05%，Κ2ΗΡ04 · Η200. 14%， ρΗ8· 5_9· 0〇7. -种初筛半固体培养基，其特征在于：所述初筛半固体培养基各组分的质量百分含 量为：L-天冬氨酸2%，葡萄糖3%，蛋白胨1%，酵母粉0. 2%，NaCll. 5%，ΚΗ2Ρ04 0. 05%， Κ2ΗΡ04 · Η200· 14%，MgS04 · 7Η200· 03%，CaCl20. 05%，琼脂 0· 8%，ρΗ8· 5-9. 0 ;将所述初筛 半固体培养基分装于96孔酶标板，制得初筛半固体培养基孔板。8. 权利要求7所述的初筛半固体培养基在对耐碱L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高 通量筛选中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。该方法包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)然后将平板分离得到的单菌落接种96微孔板初筛半固体培养基，初筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；3)对初筛得到的菌株接种24孔板液体培养，结合纸层析法复筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；4)对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵，结合氧化显色法确认酶活性。本发明方法适用于L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选，筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。
【IPC分类】C12Q1/527, C12R1/40, C12Q1/04
【公开号】CN105648036
【申请号】
【发明人】李东升, 傅风华, 张淑敏, 杨小平
【申请人】山东国际生物科技园发展有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月17日