一种微藻混合培养制备油脂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种能够耐受高浓度C02并在碱 性环境下微藻混合培养制备油脂的方法。
【背景技术】
[0002] 由于化石能源的日趋减少和使用化石能源造成温室效应的增加，越来越多的科研 工作者把目光集中到可再生能源的开发和利用上。生物质能作为地球上最重要的可再生能 源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是 重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长 周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微 藻的太阳能转化效率可达到3. 5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻 中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。
[0003] 随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的 日益恶化，特别是C02的急剧增加引起的温室效应越来越严重，微藻的生长周期短、光合效 率高，C0 2固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10倍以上，不仅可以减少C02排放，同时 也降低了培养成本；除〇) 2外，废气中的一些SOx、NOx等成分也随着微藻的代谢被净化处 理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能 满足世界运输所需燃料的可再生能源。
[0004] 目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株 栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产 率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括co2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、 色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN20120154470.4公开了一株富油海洋微藻微拟球藻（ yVaiMocAJoro/wis )藻株及其应用，该藻株可在pH=4. 5的环境下正常生长，其油 脂含量可达35%。CN20111019480. X公开了一株微藻藻株耶.）及其用于生 产生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸C18:3和 神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。这些专利都未涉及藻种 对二氧化碳的耐受性。CN102703326A公开了一种高C0 2耐受性和固定率的微藻及其选育方 法，但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。上述专利要么不能高效利用〇) 2生 产油脂，要么获得的生物质中油脂含量不够高。特别是在实际应用中，当环境中C02体积分 数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固碳效率低；同时一般微藻在中性条件下适 宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微藻的生长，而微藻利用〇) 2-般是以溶解在 水中的HC03离子形式存在的，二氧化碳在中性环境下溶解度低，不利于藻类吸收利用。
[0005] 刘平怀等(有机碳源对单针藻细胞生长、油脂积累和光合作用的影响，生物工程， 2012，33(18): 224-246)介绍了利用有机碳源培养单针藻的一种生产方式，培养结束虽然 生物量超过了 l〇g/L，但该种方式为单针藻异养培养方式，培养过程中利用葡萄糖等有机碳 源来实现细胞生长，这种培养方式没有利用〇) 2等无机碳源经济，而且有机碳源的加入，在 培养过程易产生染菌问题，影响藻细胞的生长。
【发明内容】
[0006] 针对现有藻种不能满足耐受和吸收高浓度C02，固定C02效率低的问题，本发明提 供了一种能够耐受高浓度C0 2并在碱性环境下微藻混合培养制备油脂的方法。本发明方法 提高了微藻培养体系对高浓度co2的耐受性和溶解性，提高了固碳效率，微藻油脂的收获量 明显提高，能够进行生物柴油的生产。
[0007] 本发明微藻混合培养制备油脂的方法，包括如下内容：（1)将微藻培养基与斜生 栅藻FSH-Y2种子液加入到光生物反应器中，调节培养体系的pH值为10~12,通入气体 中C0 2的含量控制在5v%以下，培养2~5天；（2)调节培养体系的pH值为8~10,接入 纤维藻SS-B7种子液进行混合培养，通入气体中C0 2含量为5v%~45v%，；（3)培养至生长 稳定期结束，收获微藻细胞；所述的斜生栅藻（FSH-Y2和纤维藻 耶.）SS-B7,分别于2012年9月11日和2013年4月15日保藏于"中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"，保藏编号分别为CGMCC No. 6551和CGMCC No. 7478〇
[0008] 本发明所述FSH-Y2藻株在显微镜下藻细胞呈纺锤形，丛生，有细胞壁膜包裹，颜 色为深绿色；单个藻细胞直径约为6~10 μ m。该藻株在高pH值下能够更好的吸收利用二 氧化碳，快速生长繁殖。
[0009] 本发明所述纤维藻SS-B7藻株是一种淡水绿藻，在显微镜下藻细胞为绿色，镰形 或弓形、丛生、弯曲，自中央向两端渐尖细，末端尖，长大约5~6μπι，中央宽约2μπι。该藻 株能够耐受高浓度的〇) 2和NOx，可以利用含C0 2和NOx的废气或烟气进行光照自养生长获 取富含油脂的生物质，固碳效率高。
[0010] 本发明中，微藻培养基采用本领域人员熟知的BG11、SE、BBM等培养微藻的液体培 养基。斜生栅藻FSH-Y2种子液的制备如下：将培养基的pH调节为10~12,在温度为20~ 30°C，光照周期为24h，光暗时间比为14:10,光照强度为2000~lOOOOLux，振荡培养至对数 生长期。光生物反应器中加入的斜生栅藻FSH-Y2种子液与培养基的体积比1:10~1:5,通 入气体为二氧化碳和氮气，其中C0 2的含量控制在3v%~5v%。
[0011] 本发明中，纤维藻SS-B7种子液的制备如下：将培养基的pH调节为7~9,在温度 为20~30°C，光照周期为24h，光暗时间比为14:10,光照强度为2000~lOOOOLux，振荡培 养至对数生长期；纤维藻SS-B7种子液与培养基的体积比为1:20~1:10。混合培养的培养 温度为20~30°C，光照周期为24h，光暗时间比为14:10,光照强度为2000~lOOOOLux。通 入气体优选使用含C0 2的废气或烟气，其中C0 2含量为10v%~45v%，NOx含量为100 X 10 6~ 500X 10 6 (v/v)。混合培养至生长稳定期结束，通过离心、沉降等方式收获微藻细胞，测定 细胞干重和油脂含量，细胞干重可达到12g/L以上，油脂含量可达到细胞干重的45%以上。
[0012] 与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果： 1、本发明采用两步法接入不同的微藻种子液进行混合培养，反应初期接入耐受高pH 的斜生栅藻FSH-Y2藻株在碱性条件下生长，可以抑制微藻培养初期杂菌和病虫害的生长， 使微藻处于生长优势；同时高pH培养有利于通入高浓度二氧化碳的溶解，使二氧化碳更容 易被微藻吸收利用，有助于提高二氧化碳的固定效率； 2、 在利用二氧化碳和光照获得生物质的培养过程中，微藻混合培养并非是微藻单独培 养的简单组合，这两种藻种互相配合，比单一藻种具有更高的的固碳效率和获取更多的生 物质和油脂含量； 3、 本发明的混合培养体系能够耐受高浓度的0)2和NOx，可以利用废气中的C0 2进行自 养生长，固定C02，缓解目前工业社会带来的温室效应和废气污染问题。
【具体实施方式】
[0013] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，wt%为质量分数，V%为体 积分数。
[0014] 实施例1微藻种子液的制备 微藻培养米用BG11培养基，培养基配方如表1和表2所不。
[0015] 表1 BG11培养基
*表2表1中A5+Co solution的组成
首先按照表1和表2制备BG11液体培养基，将培养斜生栅藻FSH-Y2的培养基的pH调 节为10,将培养纤维藻SS-B7的培养基的pH调节为7. 5,然后将斜生栅藻FSH-Y2和纤维藻 SS-B7分别接种于上述培养基中。在恒温光照摇床中培养，培养温度为25°C，光照周期为 24h，光暗时间比为14:10,光照强度为5000Lu X，120rpm振荡培养至对数生长期，获得斜生 栅藻FSH-Y2种子液和纤维藻SS-B7种子液，将上述种子液在15°C弱光下保存备用。
[0016] 实施例2微藻油脂的制备 (1)在光生物反应器中，加入实施例1制备的FSH-Y2种子液和微藻培养基，FSH-Y2种 子液与培养基的体积比为1:5,培养基采用BG11培养基，培养基的pH值控制为10,培养的 光照强度为5000LUX，光照周期为24h，光暗时间比为14:10,通入氮气和二氧化碳的混合气 体，其中二氧化碳含量为5v%。
[0017] (2)培养2天后，接入实施例1制备的纤维藻SS-B7种子液，