一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方法，属 于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 天然虾青素(3,37 -二羟基-4,(-二酮基-β,Κ-胡萝卜素)是类胡萝卜素的最高级衍 生物，结构的特殊性决定了其抗氧化活性明显高于其他类胡萝卜素。虾青素作为强抗氧化剂 在医药、化妆品和保健品等领域有很大的应用，也作为添加剂广泛用于食品、水产等行业。
[0003] 天然虾青素主要来源于发夫酵母、鲑鱼、虾壳及雨生红球藻，其中雨生红球藻在胁 迫条件下，比如高温、强光照、氮饥饿等，能大量的积累虾青素，其含量可达到藻细胞干重的 5-6%，被称为天然虾青素的浓缩品。外源诱导子促进雨生红球藻积累虾青素是提高虾青素 产量的有效手段。丁基羟基茴香醚是一种常见脂溶性抗氧化剂，可作为一种外源诱导子对 雨生红球藻进行胁迫培养，激发植物防御基因的表达，诱导植物的化学防御，与机械损伤和 昆虫取食有相似的效果。因此丁基羟基茴香醚对雨生红球藻积累虾青素会有一定的促进作 用。
[0004] 目前国内已有多家公司可以大规模化生产虾青素，也已有了一些相关的技术和专 利，比如"一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法"（CN104529852A)公开了一种高效提取虾 青素的方法，主要利用冰醋酸冰浴、匀浆机匀浆和液氮低温处理相结合的方法，大大提高了 细胞破壁率及虾青素提取率。宁波大学的"大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及 其方法"（CN1966660)，公开了一种雨生红球藻大规模培养及奸青素转化的装置，包括光生 物反应器、充气装置、培养液灌输装置和静细胞收集装置，通过浮沉控制装置实现全天候高 密度养殖，并将藻的养殖和虾青素积累结合在同一反应器中完成。天津大学的"用酵母发酵 残液培养藻类生产虾青素的方法"（CN1480524A)，公开了一种利用酵母发酵残液生产虾青 素的方法，是向酵母发酵残液中加入无机盐配成培养基，在特定的容器内培养雨生红球藻 或绿球藻，经过分离提取虾青素。上述相关专利技术虽然先进，但是工艺较为复杂，设备要 求高，操作较为繁琐，这就增加了生产的成本和技术推广的难度。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题克服现有的缺陷，提供一种利用丁基羟基茴香醚促进雨 生红球藻生产虾青素的方法，可以有效解决【背景技术】中的问题。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0007] 本发明提供一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以 下步骤：
[0008] 步骤1、藻液的制备:培养雨生红球藻到对数生长期后期，用缺氮的BBM培养基稀释 藻液并获得诱导的藻液；
[0009] 步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：用DMS0配成128g Γ1的丁基羟基茴香醚母液， 将丁基羟基茴香醚母液添加到已经稀释好的诱导的藻液中使丁基羟基茴香醚浓度达到2-8mg Γ1;然后将上述藻液进行培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞；
[0010]步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素。
[0011] 2、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方 法，其特征在于，所述雨生红球藻为雨生红球藻菌株。
[0012] 3、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方 法，其特征在于，所述步骤1中藻液的制备具体为:在25°C、光强30001x，持续光照条件下培 养，培养雨生红球藻到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到l〇 6cells ml/1，利用缺氮的 BBM培养基稀释到2X 105cells mL-1作为诱导藻液。
[0013] 4、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方 法，其特征在于，所述步骤2中诱导雨生红球藻积累虾青素中的培养条件为：28°C、光强 ΙΟΟΟΟΙχ、冷光灯连续光照及氮饥饿的复合胁迫。
[0014] 5、根据权利要求1所述的利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方 法，其特征在于，所述步骤3中利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素具体为:取5ml上述藻液， 4000r/min离心5min，弃上清得藻细胞沉淀；分别向藻细胞沉淀中加入2mL 30 %甲醇和5 % Κ0Η混合液，60 °C水浴15min，4000r/min离心10min，除上清，沉淀加入纯水洗涤2次，除碱液 残留；然后加入5mL DMS0,200w超声破壁15min，其中，超声lmin，10s间歇，于45°C水浴 20min，抽提至藻体发白，离心收集上清测0D490;并按照公式= (4,SA XVa) /Vb计 算得出虾青素的含量，其中C为虾青素含量，A为490nm下0D值，Va为DMS0体积，Vb为藻液体 积。
[0015] 本发明所达到的有益效果是:一方面本发明操作简单易行、成本低，原材料为自己 筛选的雨生红球藻菌株可按常规方法培养，另一方面本发明大幅提高了虾青素的产率，实 验证明，添加2-8mg I/1的丁基羟基茴香醚的诱导组比对照组积累虾青素的周期缩短了6-13%，虾青素的产量比对照组提高了56.14-71.72%，达到19.99-21.654mg L一、
【具体实施方式】
[0016] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0017] 本发明提供一种利用丁基羟基茴香醚促进雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以 下步骤：
[0018] 步骤1、藻液的制备:雨生红球藻采用雨生红球藻菌株，利用BBM培养基，在25°C、光 强30001x，持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长期后期，此时藻细胞浓度达 到10 6cells ml/1，无菌条件下离心，利用缺氮的BBM培养基稀释到2 X 105cells ml/1作为诱 导藻液；
[0019] 步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：用DMS0配成128g Γ1的丁基羟基茴香醚母液， 将丁基羟基茴香醚母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使丁基羟基茴香醚浓度达到2_8mg Γ 1;然后将上述藻液在28°C、光强ΙΟΟΟΟΙχ、冷光灯连续光照及氮饥饿的复合胁迫下进行培 养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞；
[0020] 步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素，虾青素的提取方法：
[0021 ] 每隔一天取5ml上述藻液，4000r/min离心5min，弃上清得藻细胞沉淀;分别向藻细 胞沉淀中加入2mL 30 %甲醇和5 %KOH混合液，60°C水浴15min，4000r/min离心10min，除上 清，沉淀加入纯水洗涤2次，除碱液残留；然后加入5mL DMS0,200w超声破壁15min(超声 lmin，10s间歇），于45°C水浴20min，抽提至藻体发白，离心收集上清测0D490;并按照公式 (4、SAxVd /V'fc计