匀，获得混匀后的发酵培养基;混匀后的发酵培养加入10公斤地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)HL-3种子液，搅拌并混合均勾;接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为8厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为55°C，发酵时间为45h;发酵结束后，将固态发酵产物与水按质量比为1:3的比例混合并搅拌均匀，加入到酶解罐中，控制酶解温度为550C，酶解2h;将上面得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液，酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液;透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液;浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
[0019]实施例2:将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌(BaciI Iuslicheniformis)HL-3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55°C、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)HL_3种子液备用。将新鲜的南美白对4下的4下头绞碎后备用;将花生柏粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的虾头和100公斤粉碎并过60目筛的花生柏混合，并加入6公斤玉米粉、510克食品级氯化钙、550克食品级氯化亚铁、580克食品级磷酸氢二钾和8公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基;混匀后的发酵培养加入9公斤地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)HL-3种子液，搅拌并混合均勾;接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为4厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为60°C，发酵时间为48h;发酵结束后，将固态发酵产物与水按质量比为1:3的比例混合并搅拌均匀，加入到酶解罐中，控制酶解温度为55°C，酶解2h;将上面得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液，酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液;透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液;浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
[0020]实施例3:将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌(Baci I Iuslicheniformis)HL-3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55°C、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)HL_3种子液备用。将新鲜的去壳后的牡■绞碎后备用;将豆柏粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的牡蛎和100公斤粉碎并过60目筛的豆柏混合，并加入4公斤玉米粉、560克食品级氯化钙、550克食品级氯化亚铁、650克食品级磷酸氢二钾和8公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基;混匀后的发酵培养加入9公斤地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)HL-3种子液，搅拌并混合均勾;接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为6厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为57°C，发酵时间为46h;发酵结束后，将固态发酵产物与水按质量比为1:3的比例混合并搅拌均匀，加入到酶解罐中，控制酶解温度为55°C，酶解2h;将上面得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液，酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液;透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液;浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
【主权项】
1.本发明公开了一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于:该方法包括如下步骤: (1)将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌(BaciIIuslicheniformis)HL_3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55 °C、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HL-3种子液备用； (2)将新鲜的水产蛋白绞碎后备用，将植物蛋白粉碎后过60目筛备用； (3)将步骤(2)制得的绞碎水产蛋白和粉碎后的植物蛋白按质量比为0.5?1.5:1的比例混合，并加营养物和水混匀，获得最终水分含量控制在40%?80%范围内的发酵培养基； (4)往步骤然(3)制得的发酵培养基上接入步骤(I)所制备的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)HL_3 种子液，并混勾； (5)固态发酵:将步骤(4)获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵:发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm?8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在55°060°C，发酵时间为38h?48h; (6)液态酶解:将步骤(5)得到固态发酵产物与水按质量比为1:3的比例混合，并搅拌均匀后加入到酶解罐中，控制酶解温度为55°C，酶解2h; (7)成品的加工:将步骤(6)得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液;酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液;透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液;浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。2.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(I)中所用的地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)HL_3在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No: 60003。3.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、牡蛎、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。4.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的植物蛋白为豆柏、花生柏、棉籽柏和菜柏中的一种或其中两种以上的混合物。5.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的营养物为玉米粉、食品级氯化钙、食品级氯化亚铁和食品级磷酸氢二钾组成的混合物。6.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为:玉米粉0.01%?5%，食品级氯化钙0.01%?5%，食品级氯化亚铁0.01%?5%，食品级磷酸氢二钾0.01%?5%。7.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述步骤(4)中地衣芽孢杆菌(BaciIIus licheniformis)HL_3种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为I %?15% ο
【专利摘要】本发明公开了一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，包括以下主要步骤：将新鲜的水产蛋白绞碎后备用，将植物蛋白粉碎后过60目筛备用；绞碎后的水产蛋白和粉碎的植物饲料蛋白混合，并添加营养物和水混匀作为发酵培养基；往发酵培养基上接入能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（<i>Bacillus？licheniformis</i>）HL-3；接入菌种的培养基于55℃～60℃进行固态好氧发酵38h～48h；然后固态发酵产物加水于55℃酶解2h；液态酶解产物先后经过滤、超滤和纳滤后得到浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得到活性肽成品。本发明技术作用条件温和，更多地保留了制备的功能肽和原料本身所含其它功能性成分的生物学活性，并且简化了制备工序和降低了活性肽的生产成本，有着良好的应用前景。GDMCC No：6000320160118
【IPC分类】C12P21/00, C07K1/34, C12R1/10, C12P21/06
【公开号】CN105648012
【申请号】
【发明人】洪鹏志, 刘唤明, 周春霞, 杨萍
【申请人】广东海洋大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月9日