一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种抗氧化活性肽的制备方法，具体涉及一种激活Nrf 2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]鲨鱼全身是宝，有的种类肉质鲜美，是餐桌上常见的菜肴。鱼皮具有良好的韧性，是皮革加工业的原料。现代医学证明鲨鱼软骨也具有很大的药用价值，1992年美国首先将鲨鱼软骨粉直接用于临床治疗肿瘤。
[0003]双髻藍(Sphyrna Iewini)为软骨鱼纲，真藍目，双髻藍科，在我国主要分布于黄海、东海和南海。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种具有激活Nrf2_ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法。
[0005]本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:一种具有激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法，其包括以下步骤:
1)双髻鲨鱼肉的预处理:取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至90?95°C后保温5?1min，然后按照料液比Ig: 2?4mL加入异丙醇，于25?30°C、功率450?500 W超声提取2?3 h，然后于4°C、9000~10000 rpm离心10?15min除去异丙醇，收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物；
2)脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解:取脱脂双髻鲨鱼肉固形物，按固液比Ig:1OmL?15mL加入甘氨酸一氢氧化钠缓冲液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH调节pH到9.0?10.0，得混合液;将混合物温度调制55?65°C，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2 %?1.5 %加入碱性蛋白酶(酶活力2 1.95X 105 U/g)，酶解时间2 h?2.5h后，酶解液于90?95°C保温10?15min，灭酶活;将酶解液温度调至35?45°C，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0 %?1.2%加入胰蛋白酶(酶活力22.5\104 U/g)，酶解时间3 h?4 h，酶解液于90?95°C保温10?15min后降至室温，于10000?12000 rpm离心10?15 min，取上清液。
[0006]3)双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备:将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化，得双髻鲨鱼肉抗氧化肽。
[0007]作为优选，所述步骤3)的超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为:
超滤:将上述酶解上清液采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液。
[0008]大孔树脂精制:将超滤酶解液配成15?20mg/mL的溶液，缓慢加入到超滤酶解液与DlOl大孔树脂比为1:10?15的玻璃柱中，用3?5倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用3?4倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为大孔树脂精制多肽。
[0009]凝胶柱层析:将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为20?30mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶Sephadex G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.8?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的轻基自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对羟基自由基的清除活性得I个高抗氧化活性多肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ESI_MS测定分子量为610.77 Da。
[0010]再优选，所述RP-HPLC条件为:进样量15?20 yL;色谱柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι)；流动相:水-乙腈梯度洗脱(O?45min乙腈浓度由O匀速升至45%);洗脱速度
0.8~1.0 mL/min;紫外检测波长220 nm。
[0011]与现在技术相比，本发明所提供的一种激活Nrf2-ARE通路的双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法，其特征在于Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)还可促进Nrf2蛋白质积累，激活Nrf2-ARE通路，进而上调抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保护机体免受毒物的损伤。因此，Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治疗肝损伤、皮肤光老化、动脉硬化、中风、糖尿病和肥胖等与Nrf2-ARE通路密切相关疾病治疗的药物或功能产品。。
【附图说明】
[0012]图1是本发明的葡聚糖凝胶SephadexG_25层析图。
[0013]图2葡聚糖凝胶Sephadex G-25制备酶解物的RP-HPLC色谱图。
[0014]图3Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)对Nrf2 蛋白质水平的影响。
【具体实施方式】
[0015]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016]实施例:
双髻鲨鱼肉抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下:双髻鲨鱼肉〃双酶酶解〃酶解物"超滤〃大孔树脂纯化〃凝胶过滤层析〃高效液相色谱制备〃抗氧化肽。
[0017]I)双髻鲨鱼肉的预处理:取双髻鲨鱼肉用高速组织捣碎机处理成匀浆，加热至95°(:后保温811^11，然后按照料液比18:3 mL加入异丙醇，于25°C、功率500 W超声提取3 h，然后于4°C、10000 rpm离心10 min除去异丙醇，收集脱脂双髻鲨鱼肉固形物；
2)脱脂双髻鲨鱼肉固形物的酶解:取脱脂双髻鲨鱼肉固形物，按固液比I g:12 mL加入甘氨酸一氢氧化钠缓冲液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH调节pH到9.5，得混合液;将混合物温度调制60 0C，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.2%加入碱性蛋白酶(酶活力2 1.95 X 105 1]/^)，酶解时间2.5 h后，酶解液于95°C保温15min，灭酶活;将酶解液温度调至40 V，按照脱脂双髻鲨鱼肉固形物质量的1.0%加入胰蛋白酶(酶活力> 2.5 X 14 U/g)，酶解时间34 h，酶解液于95°C保温15min后降至室温，于12000 rpm离心10 min，取上清液。
[0018]3)双髻鲨鱼肉抗氧化肽的分离制备:将上述上清液依次经超滤、大孔树脂纯化、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化，得双髻鲨鱼肉抗氧化肽。
[0019]①超滤:将上述酶解上清液采用采用IkDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液。
[0020]②大孔树脂精制:将超滤酶解液配成20mg/mL的溶液，缓慢加入到滤酶解液与D1I大孔树脂重量体积比(mg/mL )为1: 15的玻璃柱中，用3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，再用4倍柱体积的95%乙醇洗脱，收集95%乙醇洗脱物，喷雾干燥，即为大孔树脂精制多肽。
[0021]③凝胶柱层析:将上述大孔树脂精制多肽溶于双蒸水配成浓度为