一种棘白菌素b微生物酶转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种棘白菌素 B微生物酶转化方 法。
【背景技术】
[0002] 棘白菌素类（Echinocandins)是20世纪70年代末期发现的一组天然产物，具 有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征，能够非竞争性抑制真菌细胞壁 β -1，3-葡聚糖合成酶活性，临床上作为抗真菌药物使用。
[0003] 棘白菌素 B ( Echinocandin Β，简称ECB)由构巢曲霉（Aspergilus nidulans)代 谢产生，是棘白菌素类中的一种，其结构如下：
棘白菌素 B经脱酰酶作用得到环肽母核（Echinocandin B Nucleus，ECBN)，环肽母核 再经过化学修饰可制备得到抗真菌药物阿尼芬净（Anidulafungin )。目前对于ECB母核的 制备，化学合成方法成本较高，主要采用微生物转化。微生物转化具有以下优点：反应条件 温和，产物单一，高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性，易于纯化，环境污染小， 且能完成一些化学合成难以进行的反应。
[0004] 棘白菌素 B母核（ECBN)具有如下结构：
US7785826B2详细介绍了 ECB转化ECBN的工艺。此工艺主要流程包括： 将ECB发酵完成以后，离心获得菌丝体，把菌丝体重新悬浮于水中然后加入脱酰酶进 行转化。但此方法的摩尔转化率较低，转化时间长，转化需耗时20~30h，生产成本较高。
[0005] CN103374593A公开了一种在发酵过程中添加棘白菌素 B (ECB)底物转化为棘白菌 素 B母核的方法；CN102618606B公开了一种棘白菌素类化合物的生物转化方法，包括，将棘 白菌素类化合物、缓冲溶液以及助溶剂混合后，再加入全细胞脱酰基酶进行转化；当前文献 报道的这些转化方法，主要是犹他游动放线菌（Actinoplanesutahensis)或其它基因工程 菌发酵产生脱酰酶，然后将底物加入到发酵液中进行转化。这一转化体系的缺点在于，存在 大量微生物，稳定性差，受发酵液酶活的限制导致投入的ECB底物浓度偏低，产生的ECB母 核浓度偏低，整个体系体积较大，不易于分离纯化，且体系中大量菌体和ECB等不溶物的存 在导致未转化的ECB难以回收，生产成本较高。
[0006] CN103074403B公开了一种将ECB转化为ECBN的方法，涉及发酵完成后通过加磷酸 盐、超声、离心、旋蒸浓缩，得到棘白菌素 B脱酰酶酶液，然后加入ECB底物进行转化。该方 法不足之处在于粗酶提取过程繁琐，不利于工业化放大生产；使用旋蒸的方式提取粗酶，由 于温度偏高，易造成蛋白质变性，脱酰酶的活力有负面影响。
[0007] 因此需要开发一种粗酶提取方式简单、条件温和，成本较低，酶活受到的负面影响 较小，同时转化效率高，易于分离纯化，ECB易于回收重复使用的工艺。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于，针对现有转化工艺存在的不足，提供一种高效的将棘白菌素 B 转化为棘白菌素 B母核的方法。
[0009] 为达到上述目的，本发明提供以下技术方案： 将棘白菌素 B转化成棘白菌素 B母核的方法，包括以下步骤： 1)、发酵能将棘白菌素 B脱酰酶表达在胞外的基因工程菌，获得棘白菌素 B脱酰酶； 2 )、发酵完成后，将发酵液过滤或离心，得到上清液，向上清液中加入上清液体积的 40%~80%(w/v)重量的非重金属盐，搅拌2~8小时，过滤或离心，收集沉淀，得到粗酶； 3) 、将棘白菌素 B溶于甲醇、乙醇或二甲基亚砜中，得到质量浓度为5°/d5%的棘白菌素 B溶液； 4) 、将步骤3)制备的棘白菌素 B溶液和步骤2)制备的粗酶分别分批加入到磷酸盐缓 冲液中，搅拌，使棘白菌素 B转化为棘白菌素 B母核，监测转化体系中棘白菌素 B及棘白菌 素 B母核浓度，当棘白菌素 B浓度不再减少，棘白菌素 B母核浓度不再增加时，结束转化。
[0010] 其中，优选，步骤2)所述的非重金属盐为硫酸铵； 步骤4)所述磷酸盐缓冲液浓度为0. 05~0. 15M ;进一步的，步骤4)所述磷酸盐缓冲溶 液用盐酸调节pH至5~7,最优选步骤4)所述磷酸盐缓冲溶液用盐酸调节pH至5. 5~6. 5。
[0011] 进一步的，步骤4)分批添加粗酶次数为3~6次，每次间隔2~8小时，每次添加量为 转化反应溶液体积的1%~4%(w/v)。
[0012] 进一步的，步骤4)分批添加棘白菌素 B底物次数为2~5次，每次间隔2~8小时，每 次添加量以棘白菌素 B计算相当于转化反应溶液体积的0. P/cM). 4% (w/v)。
[0013] 进一步的，步骤4)加入到磷酸盐缓冲溶液中的棘白菌素 B的初始量为反应溶液 体积的〇. P/cM). 4% (w/v);加入到磷酸盐缓冲溶液中粗酶的初始量为转化反应溶液体积的 1%~4°/〇 (w/v) 〇
[0014] 进一步的，步骤4)转化过程中采用HPLC监测转化体系中棘白菌素 Β及棘白菌素 Β母核浓度，其中棘白菌素 Β的HPLC检测的条件如下： 色谱柱规格：C18柱2. 8Mm，流动相：甲醇：乙腈：水=70:10:20(V/V)，柱 温：40°C，流速：0· 3ml/min，波长：210nm，保留时间：约 5. 5min ; 棘白菌素 B母核的HPLC检测的条件如下： 色谱柱规格C18柱4. 6mm*250mm*5Mm，波长：210nm，柱温：40°C，流速：lml/min，采用 梯度洗脱，流动相A相：0. 5%磷酸二氢铵水溶液（W/V):甲醇=95:5 (V/V)，流动相B相： 0. 5%磷酸二氢铵水溶液（W/V):甲醇=70:30 (V/V)，
保留时间约10.0 min。
[0015] 其中，上述方法中，步骤1 )，发酵所用菌株为能将棘白菌素 B脱酰酶表达在胞外 的基因工程菌，例如白色链霉菌基因工程菌株（Str印tomyces albus)，（参见"Efficient Bioconversion of Echinocandin B to Its Nucleus by Overexpression of Deacylase Genes in Different Host Strains[J]. Appl Environ Microbiol, 2013 Feb; 79(4): 1126-33)，可采用本领域技术人员熟知的条件进行棘白菌素 B脱酰酶的发酵，例如包括但 不限于CN102618606B中公开的发酵方法。
[0016] 步骤2)，发酵完成后，需要对发酵液中棘白菌素 B脱酰酶进行简单的粗提。因所用 菌株产生的棘白菌素 B脱酰酶在胞外，故首先将发酵液固液分离，得到含棘白菌素 B脱酰酶 的上清液。利用盐析的原理，沉淀、分离粗酶；所述盐析原理是指高浓度的盐离子在蛋白质 溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液 中沉淀出来，同时可将盐析出来的蛋白质再次溶于水而不影响原蛋白质的性质。盐析一般 选用溶解度高的非重金属盐如氯化钠、氯化铵、硫酸钠、硫酸铵等。硫酸铵因其溶解度大，温 度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。因此按照上清液体积的40~80%(质量体积比） 加入硫酸铵，搅拌2~8小时，溶液过滤或离心，收集沉淀，得到粗酶。
[0017] 由于棘白菌素 B的水溶性极差，步骤3)，采用甲醇、乙醇或二甲亚砜作为助溶剂， 制备质量浓度为5°/d5%的棘白菌素 B溶液，有助于将棘白菌素 B添加到反应体系中时充分 混匀和转化。
[0018] 转化体系中采用浓度为0. 05~0. 15M，pH约5. 5~6. 5的磷酸盐缓冲液，提供了一定 离子强度及稳定的pH环境，有利于转化过程中棘白菌素 B脱酰酶的溶解和脱酰酶的稳定。
[0019] 步骤4)，向磷酸盐缓冲液分批添加粗酶及棘白菌素 B，28~32°C搅拌并进行转化。 现有技术中，由于棘白菌素 B在转化过程中，脱酰酶会逐渐失活，转化效率下降，本发明采 用分批的形式添加粗酶有利于满足并维持反应体系中底物转化所需的酶活，提高转化效 率，优选地，添加粗酶次数为3~6次，每次间隔2~8小时，每次添加量为转化反应溶液体积的 1%~4%(质量体积比）。
[0020] 由于棘白菌素 B的水溶性极差，即使通过助溶剂如甲醇、乙醇或二甲基亚砜加入 到反应体系中也容易在水溶液中逐渐析出，需要加入较多的助溶剂才能达到较好的结果， 而有机溶剂过多会造成蛋白质变性，导致脱酰酶失活，转化能力下降；为解决上述问题，本 发明采用分批的形式添加底物棘白菌素 B溶液有利于保持酶活，使反应体系中棘白菌素 B 分散混匀转化更充分，使得反应体系能够转化更多的棘白菌素 B，得到更高浓度的棘白菌素 B母核，利于分离纯化。优选地，添加棘白菌素 B底物次数为2~5次，每次间隔2~8小时，每 次添加量以棘白菌素 B计算相当于转化反应溶液体积的0. P/cM). 4% (w/v)。
[0021] 本发明的粗酶提取方式简单、条件温和，成本较低，酶活受到的负面影响较小。同 时本发明通过优化粗酶和棘白菌素 B的投料方式提高了反应体系的底物浓度以及转化得 到的母核浓度，提高了转化效率，更加有利于分离纯化。并且由于整个反应体系的构成较为 简单，仅包含水溶性的磷酸缓冲盐、粗酶、棘白菌素 B母核以及不溶于水的棘白菌素 B底物， 转化结束之后棘白菌素 B母核存在于水溶液中，残余的少量固形物主要为棘白菌素 B底物， 利于过滤。可通过过滤的方式得到棘白菌素 B母核溶液对棘白菌素 B母核进行下一步的提 取，同时沉淀的棘白菌素 B底物可简易回收再利用，降低了生产成本，适于大规模的工业生 产，具有很好地商业价值。另外转化体系中磷酸盐缓冲液，提供了一定离子强度及稳定的pH 环境，有利于转化过程中棘白菌素 B脱酰酶的溶解和脱酰酶的稳定。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不意味着对本发明有任何限制。
[0023] 实施例1产棘白菌素 B脱酰酶菌株的发酵及粗酶制备 菌种：白色链霉菌（Streptomyces albus)，保藏号：ATCC21725 ;_80°C冷冻管保存； 种子培养基：热炸黄豆饼粉0. 5%，酵母粉0. 5%，蛋白胨0. 5%，葡萄