/L的乙酸丁酯作为萃取剂，进行酶解反应。酶解PH值为4.5，温度为50°C，酶解30h后，加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的PH至6.0，然后离心得到脱毒后的酶解液，将脱毒后的酶解液加入到反应器，加入除氧剂并通入高纯氮气保持无氧环境后加入P2培养基(以g/L计为:酵母1.0, CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01, MgSO4-7H20 0.2，FeSO4 0.01，对氨基苯甲酸0.001，维生素B1 0.001，生物素0.01X10 3)，然后接入丙酮丁醇梭菌ip1stridiimacetobutylicum) ATCC 824，购于美国模式菌种收集中心，接种量为10%，发酵温度为37°C，发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为11.73g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为58.69g/L，发酵后得水解液中葡萄糖浓度为1.4 g/L。
[0021]实施例2 控制酶解体系总质量为2kg，按照干物浓度为20wt%加入预处理好的玉米秸杆(PCS)，控制酶加量为10IU/g纤维素干基，同时加入0.08mol/L的乙酸丁酯作为萃取剂，进行酶解反应。酶解PH值为5.0，温度为52°C，酶解20h后，加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的PH至7.0，然后离心得到脱毒后的酶解液，将脱毒后的酶解液加入到反应器，加入除氧剂并通入高纯氮气保持无氧环境后加入P2培养基(以g/L计为:酵母1.0, CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01, MgSO4-7H20 0.2，FeSO4 0.01，对氨基苯甲酸0.001，维生素B1 0.001，生物素0.01X10 3)，然后接入丙酮丁醇梭菌ip1stridiimacetobutylicum) ATCC 824，购于美国模式菌种收集中心，接种量为10%，发酵温度为37°C，发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.10g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为67.69g/L，发酵后得水解液中葡萄糖浓度为9.3 g/L。
[0022]实施例3
控制酶解体系总质量为2kg，按照干物浓度为30wt%加入预处理好的玉米秸杆(PCS)，控制酶加量为20IU/g纤维素干基，同时加入0.lmol/L的乙酸丁酯作为萃取剂，进行酶解反应。酶解PH值为5.5，温度为48°C，酶解25h后，加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的PH至8.0，然后离心得到脱毒后的酶解液，将脱毒后的酶解液加入到反应器，加入除氧剂并通入高纯氮气保持无氧环境后加入P2培养基(以g/L计为:酵母1.0, CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01, MgSO4-7H20 0.2，FeSO4 0.01，对氨基苯甲酸0.001，维生素B1 0.001，生物素0.01X10 3)，然后接入丙酮丁醇梭菌ip1stridiimacetobutylicum) ATCC 824，购于美国模式菌种收集中心，接种量为10%，发酵温度为370C，发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.38g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为65.37g/L，发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为4.53g/L。
[0023]实施例4
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于接入拜氏梭菌CM20进行发酵。接种量为8%，发酵温度为37°C，发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.15g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为58.69g/L，发酵后测得水解液中无残糖。
[0024]实施例5
处理工艺及操作条件同实施例2，不同之处在于接入拜氏梭菌CM20进行发酵。接种量为8%，发酵温度为37°C，发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.51g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为67.69g/L，发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为7.27g/L。
[0025]实施例6
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于在酶解过程中，同时加入0.1 mo I/L的Gemini表面活性剂。发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.llg/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为62.69g/L，发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为3.6g/L。
[0026]实施例7
处理工艺及操作条件同实施例4,不同之处在于在酶解过程中，同时加入0.25mol/L的Gemini表面活性剂，接入拜氏梭菌CM20进行发酵。接种量为8%，发酵温度为37°C，发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.78g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为62.69g/L，发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为2.58g/L。
[0027]比较例I 处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于在酶解过程中，不加入乙酸丁酯作为萃取剂。发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为8.98g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为45.69g/L，发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为1.76g/L。
[0028]比较例2
处理工艺及操作条件同实施例1，不同之处在于采用氢氧化钠代替氢氧化钙调节pH。发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为10.08g/L，发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为58.69g/L，发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为8.76g/L。
[0029]通过上述实验结果表明，本发明在酶解过程中加入乙酸丁酯作为萃取剂，并加入Gemini表面活性剂，同时采用氢氧化钙等脱毒方法的酶解发酵工艺，大大提高了水解液中葡萄糖含量以及发酵丁醇的产量。
【主权项】
1.一种木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将预处理后的木质纤维素、纤维素酶和乙酸丁酯按一定比例加入到反应器中进行酶解； (2)采用氢氧化钙调节酶解液的pH值为6?8，于50°C反应Ih； (3)在上述酶解液中加入除氧剂，并通入惰性气体，使体系处于无氧状态； (4)在上述脱毒后的酶解液中接入丁醇发酵菌种，发酵制备丁醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)所述的木质纤维素原料为玉米秸杆，机械粉碎到粒径为0.1?30mm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)所述的预处理采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)所述酶解过程中酶加量为5?20IU/g纤维素干基，纤维素酶采用可水解木质纤维素组分的酶蛋白或酶蛋白混合物。5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于:步骤(I)所述酶解的条件为:干物浓度为5wt%?30wt%，酶解温度为45°C?55°C，酶解时间为12?40h，pH值为4.5?5.5。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)所述乙酸丁酯的加入量为0.01 ?0.lmol/L，优选为 0.05 ?0.08mol/L。7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于:步骤(I)所述酶解体系中加入Gemini表面活性剂，加入量为0.025?0.5mol/L，优选为0.1?0.25mol/L。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)采取直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至6?8，离心后去除沉淀，液体即为脱毒后的酶解液。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)所述除氧剂为保险粉，采用刃天青作为指示剂；所述惰性气体为氮气、氢气或二氧化碳。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)所述丁醇发酵菌株为拜氏梭菌{Clostridium beijerinckii )或者丙酮丁醇梭菌ace tobutylicuni)。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于:步骤(4)所述丁醇发酵菌株采用拜氏梭菌CM20,其分类命名为拜氏梭菌{Clostridium beijerinckii),已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.9354。12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)采用RCM培养基制备种子液，种子液的接种量为5%-10% (v/v);发酵温度为33-38°C，发酵时间72-84小时。
【专利摘要】本发明公开了一种木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法，包括如下步骤：（1）将预处理后的木质纤维素、纤维素酶和乙酸丁酯按一定比例加入到反应器中进行酶解；（2）采用氢氧化钙调节酶解液的pH值为6～8，于50℃反应1h；（3）在上述酶解液中加入除氧剂，并通入惰性气体，使体系处于无氧状态；（4）在上述脱毒后的酶解液中接入丁醇发酵菌种，发酵制备丁醇。本发明通过选择合适的萃取剂和脱毒剂，对预处理和酶解过程中产生的乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等发酵抑制物进行原位萃取分离，降低了抑制物对酶解和发酵的毒性，提高了丁醇产量。
【IPC分类】C12P7/16, C12R1/145, C12P19/14
【公开号】CN105647980
【申请号】
【发明人】关浩, 张全, 曹长海, 唐似茵
【申请人】中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年12月5日