一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的应用。
【背景技术】
[0002] 大豆(Glycine max L.Merr.)是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植 面积最大的作物。由于传统育种方法存在的局限性，使得转基因技术成为大豆新品种培育 的重要手段。
[0003] 目前使用较为广泛的大豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因 枪介导的幼胚转化体系为主。由于基因枪介导的幼胚转化受外植体取材的限制，实际应用 中主要还是采用根癌农杆菌介导的子叶节转化方法。现有的根癌农杆菌转化体系存在转化 效率低的问题，制约着大豆分子育种的发展。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种由系列培养基组成的试剂盒及其在大豆遗传转化中的 应用。
[0005] 本发明提供了一种用于大豆遗传转化的试剂盒，包括恢复培养基、筛选培养基、伸 长培养基和生根培养基；
[0006] 所述恢复培养基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺、28-32mg/L EDTA盐和ll-13mg/L FeS〇4;
[0007] 所述筛选培养基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺、28-32mg/L EDTA盐和ll-13mg/L FeS〇4;
[0008] 所述伸长培养基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺、28-32mg/L EDTA盐和 11-13mg/L FeS〇4;
[0009] 所述生根培养基中含有45-55mg/L L-天冬酰胺和45-55mg/L L-谷氨酰胺。
[0010]所述恢复培养基中具体含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA盐和12· 16mg/L FeS(k。所述恢复培养基的组成可如下：2·5-3·5g/L B5盐、0·5-1 ·5ml/ 1^85有机、25-358/1蔗糖、130-17011^/1头孢霉素、130-17011^/1特美汀、0.8-1.211^/16-8八、 0.8-1.2g/L 2-吗啉乙磺酸、5-10g/L 琼脂、28-32mg mg/L EDTA 盐、ll-13mg/L FeS〇4、45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述恢复培养基的组成具体如下： 3.1g/L B5盐、lml/L B5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、lmg/L 6-BA、 0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、29.84mg/L EDTA盐、12.16mg/L FeS〇4、50mg/L L-天 冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述EDTA盐具体可为Na2-EDTA。所述恢复培养基的 组成具体如下：3 · lg/L B5盐、lml/L B5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美 汀、lmg/L 6-BA、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、4ml/L Fe盐（200X)、50mg/L L-天冬 酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述恢复培养基的pH可为5-6，具体可为5.4。
[0011]所述筛选培养基中具体含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA盐和12· 16mg/L FeS〇4。所述筛选培养基的组成可如下：2·5-3·5g/L B5盐、0·5-1 ·5ml/ L B5有机、0 · 8-1 · 2g/L 2-吗啉乙磺酸、25-35g/L蔗糖、130-170mg/L头孢霉素、130-170mg/L 特美汀、〇 · 8-1 · 2mg/L 6-BA、6-1 Omg/L草丁膦、5-10g/L琼脂、28-32mg/L EDTA盐、11 -13mg/L FeS〇4、45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述筛选培养基的组成 具体如下：3.1g/L B5盐、lml/L B5有机、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢 霉素、150mg/L特美汀、lmg/L 6-BA、8mg/L草丁膦、7 · 5g/L琼脂、29 · 84mg/L EDTA盐、 12.16mg/L FeS〇4、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述EDTA盐具体可 为Na2-EDTA。所述筛选培养基的组成具体如下：3.1g/L B5盐、lml/L B5有机、0.98g/L 2-吗 啉乙磺酸、30g/L鹿糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、lmg/L 6-BA、8mg/L草丁膦、7·5g/ L琼脂、4ml/L Fe盐(200X)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述筛选 培养基的pH可为5-6，具体可为5.4。
[0012]所述伸长培养基中具体含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA盐和12·16mg/LFeS04。所述伸长培养基的组成可如下：3-5g/LMS盐、0·8-l·2ml/LB5 有机、0.5-0.78/12-吗啉乙磺酸、25-358/1蔗糖、130-1701^/1头孢霉素、130-1701!^/1特美 汀、0.08-0.1211^/11八八、0.4-0.611^/16八、0.8-1.211^/16-8八、7-911^/1草丁膦、5-1(^/1琼 月旨、28-32mg/L EDTA盐、ll-13mg/L FeS〇4、45-55mg/L L-天冬酰胺、45-55mg/L L-谷氨酰 胺，余量为水。所述伸长培养基的组成具体如下:4.Og/L MS盐、lml/L B5有机、0.6g/L 2-吗 啉乙磺酸、30g/L鹿糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0· lmg/L IAA、0.5mg/L GA、lmg/L 6-BA、8mg/L草丁膦、7.5g//L琼脂、29.84mg/L EDTA盐、12.16mg/L FeS〇4、50mg/L L-天冬酰 胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述EDTA盐具体可为Na2-EDTA。所述伸长培养基的组成 具体如下:4.0g/L MS盐、lml/L B5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉 素、150mg/L特美汀、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA、lmg/L 6_BA、8mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、 4ml/L Fe盐(200X)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述伸长培养基 的pH可为5-6，具体可为5.6。
[0013]所述生根培养基中具体含有50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺、29.84mg/L EDTA盐和12· 16mg/L FeS〇4。所述生根培养基的组成可如下：2·5-3·5g/L MS盐、0·8-1 ·2ml/ 185有机、0.5-0.78/12-吗啉乙磺酸、15-258/1蔗糖、5-1(^/1琼脂、45-5511^/11^-天冬酰 胺、45-55mg/L L-谷氨酰胺，余量为水。所述生根培养基的组成具体如下：2.165g/L MS盐、 lml/L B5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/ L L-谷氨酰胺，余量为水。所述生根培养基的pH可为5-6，具体可为pH5.7。
[0014] 以上任一所述Fe盐（200 X )的制备方法具体如下：将7.46g Na2-EDTA和5.56g FeS〇4 · 7H20溶于水并用水定容到1000ml。
[0015] 所述试剂盒还包括发芽培养基和/或液体培养基和/或共培养培养基。所述液体培 养基为用于重悬农杆菌以制备侵染菌液的培养基
[0016] 所述发芽培养基的组成可如下：2.5-3.5g/L B5盐、0.8-1.2ml/L B5有机、15-25g/ L蔗糖、5-10g/L琼脂，余量为水。所述发芽培养基的组成具体如下:3.12g/L B5盐、lml/L B5 有机、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，余量为水。所述发芽培养基的pH可为5-6，具体可为5.8。 [0017] 所述液体培养基的组成可如下：0.3-0.6g/L MS盐、0.8-1.2ml/L B5有机、30- 5〇1^/1乙酰丁香酮、13〇-17〇1^/1二硫苏糖醇、8〇-12〇11^/1^-半胱氨酸、25-358/1蔗糖、3-5mg/L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述液体培养基的组成具体如下：0.43g/L MS盐、lml/L B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L鹿糖、3 · 9mg/ L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述液体培养基的pH可为5-6，具体可为5.4。
[0018] 所述共培养培养基的组成可如下：0.3-0.6g/L MS盐、0.8-1.2ml/L B5有机、30-5〇1^/1乙酰丁香酮、13〇-17〇1^/1二硫苏糖醇、8〇-12〇11^/1^-半胱氨酸、25-358/1蔗糖、5-l〇g/L琼脂、3-5mg/L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述共培养培养基的组成具体如下:0.43g/ L MS盐、lml/L B5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、 30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、3.9mg/L 2-吗啉乙磺酸，余量为水。所述共培养培养基的pH可为5-6,具体可为5.4。
[0019] 所述试剂盒在大豆遗传转化中的应用也属于本发明的保护范围。
[0020] 本发明还保护一种大豆遗传转化的方法，包括如下步骤：
[0021] (1)将大豆外植体置于侵染菌液中室温浸泡;所述侵染菌液为重组农杆菌菌悬液； 所述重组农杆菌通过将含有目的基因的重组表达载体导入出发农杆菌得到；
[0022 ] (2)完成步骤(1)后，取外植体，在所述共培养培养基上进行培养；
[0023] (3)完成步骤(2)后，取外植体，在所述恢复培养基上进行培养；
[0024] (4)完成步骤(3)后，取外植体，在所述筛选培养基上进行培养；
[0025] (5)完成步骤(4)后，取外植体，切除子叶部分，将丛生芽转接到所述伸长培养基 上，培养至丛生芽伸长3-4cm;
[0026] (6)完成步骤（5)后，取植株，剪取茎基部以上部分，先用吲哚丁酸溶液浸泡茎基 部，然后在所述生根培养基上培养至生根。
[0027] 所述大豆外植体具体可为大豆子叶节外植体