运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法
【技术领域】
[00011本发明涉及水稻转基因材料的构建，特别涉及运用CRISPR-Cas9系统敲除MIR393b 茎环序列的基因编辑方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物，也是单子叶植物研究的模式生物。miRNA393是植 物中一个保守的microRNA家族，通过转录后水平负调控生长素受体TIRl/AFBs家族蛋白调 控生长素信号通路。目前其功能研究主要包括植物免疫反应、生长发育和胁迫反应三个方 面。而在水稻中miR393的功能还知之甚少，主要是缺乏该基因的突变体材料。
[0003] 在过去的数年中，主要采用模拟竞争靶基因的转基因手段进行水稻miRNA的功能 研究。但是模拟竞争靶基因的MM393株系并不能完全消除MIR393基因的作用，并且不能区 分MIR393a和MIR393b基因的功能，因此有必要构建其MIR393a和MIR393b各自特异的基因敲 除株系，才能阐明该家族成员MIR393a/b基因真正的生物学功能。但是至今尚未报道缺失 MIR393a或MIR393b基因的水稻突变体。
[0004] CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)序 列是一段带有间隔序列具有回文结构的多个重复序列，它源于原核生物的一种获得性免疫 系统。近年来，基于RNA介导的CRISPR-Cas系统蓬勃发展起来，该系统可定点修饰(删除、添 加、激活、抑制)革E1细胞中特定的基因序列，为革E1向性编辑基因组序列提供彳丁之有效的技术 手段。但是，目前尚无运用该技术敲除水稻MIRNA基因茎环序列的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种运用CRISPR_Cas9系统 敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法，以获得完全丧失miR393b茎环序列及其表达 的理想突变体。
[0006] 为解决技术问题，本发明的解决方案是：
[0007] 提供一种运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法，包 括以下步骤：
[0008] (l)gRNA靶位点的选择
[0009]由于MIR393b基因位于水稻基因组的第四号染色体上，根据CRISPR-Cas9技术的设 计靶位点的原则，把第一个靶位点设计在MIR393b基因的前体茎环序列上，第二个靶位点在 茎环序列下游3'端；
[0010] ⑵gRNA的片段克隆
[0011]以质粒PGTR为模板，用PCR方法克隆三个片段L1、L2、L3部分重叠的片段，引物序列 如下，其中F和R分别代表正、反向引物：
[0012] L1F：cgggtctcaggcaggatgggcagtctgggcaacaaagcaccagtgg
[0013] L1R：cgggtctcagcgttgggcttctgcaccagccggg
[0014] L2F：taggtctccacgctagcacacgttttagagctaggaa
[0015] L2R：cgggtctcattcctcaggccgtgcaccagccggg
[0016] L3F：taggtctccggaaactagtgggttttagagctagaa
[0017] L3R：taggtctccaaacggatgagcgacagcaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg
[0018] PCR体系为：Phusion酶0.5yl;5XBuffer 10μ1;引物各2·5μ1;水30yl;dNTP 4μ1; pGTR plasmid 0·5μ1;
[0019] PCR反应条件为：预变性95°C，5min;变性95°C，30s，；退火60°C，30s;延伸72°C， 30s;共33个循环；最后延伸lOmin;
[0020] PCR反应后，取5-10μ1产物，用2%的琼脂糖凝电泳检测后，纯化回收目的片段，测 定三个PCR产物LI、L2、L3的浓度；
[0021] (3)进行 GG(gRNA-gRNA)连接
[0022]根据测定的PCR浓度，将三个片段等量混合，T7酶连接反应与Bsa頂每切同时进行；
[0023] 取L1、L2、L3各2μ1，与ΙΟμΙ T7 ligase buffer、lylBsaI-HF、0.5yl T7 ligase、 2.5μ1水混合;在PCR仪中进行如下反应:37 °C，5min; 20 °C，lOmin; 30-50个循环；
[0024] (4)连接产物进行PCR扩增；
[0025] 连接反应结束后，取连接产物ΙμL，加19μ1水稀释，将稀释后的产物作为模板，以 L1F、L3R为引物做PCR扩增;PCR结束后，取5μ1产物进行电泳检测，并将产物纯化;产物大小 为350bp;
[0026] (5)将上一步纯化的产物，Fold酶切暴露黏性末端，同时Fold酶切空载体pGREB32; [0027] 酶切体系为20μ1，包括底物5μ1、FokI5yl、Buf f er 10μ1;底物包括GG纯化产物和空 载体 PGREB32;
[0028]酶切时间3_4h，酶切温度37°C ;用1 %琼脂糖凝胶检测酶切产物，并回收目标产物， 测定浓度；
[0029] (6)取酶切处理的GG产物与pGREB32载体等量混合，进行连接，连接酶为T4连接酶， 4 °C连接过夜；
[0030] (7)将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，涂板过夜;挑取单菌落，摇菌4-6h， 提取质粒，取样品进行测序;将测序结果正确的质粒，转化农杆菌EHA105;
[0031 ] (8)农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得转基因植株
[0032]以野生型水稻日本晴为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的水稻转化实验；以 EHA105农杆菌进行感染转化，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性 株系；
[0033] (9)获得阳性株系后，提取基因组DNA，在两个gRNA序列的两侧设计引物，对目的片 段进行PCR扩增，利用垂直聚丙烯凝胶电泳检测突变体；
[0034] (10)将以上突变株系PCR产物进行纯化回收，连接T载体进行测序；
[0035] (ll)miR393b 表达的检测；
[0036] 收取To代突变体植株种子，发苗，对h代植株进行纯合体筛选;提取纯合体植物叶 片组织RNA，对miR393b前体进行qRT-PCR检测分析，引物如下：
[0037] 〇sa-miR393b-qRT-up:5'CGGCCTGAGGAAACTAGTGGA 3'
[0038] 〇sa-miR393b-qRT-dn:5'GGAAGATGAGGAGGCGGAAG 3'
[0039] 产物大小：152bp
[0040] (12)经miR393b表达检测为阴性的纯合株系，即为完全丧失miR393b茎环序列及其 表达的水稻突变体。
[0041] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0042]以前主要采用模拟竞争靶基因的转基因手段进行水稻miRNA的功能抑制研究。但 是模拟竞争靶基因的株系并不能完全消除小RNA基因的作用，并且不能区分小RNA家族基因 成员的功能。而本技术采用CRISPR-Cas9方法可以祀向性的敲除特定DNA序列，尤其是可以 敲除某个特定小RNA基因的整个茎环序列，使得其功能完全丧失，从而获得有效的功能缺失 突变体。因此，本技术具有的优势是有效敲除小RNA的茎环序列，且可以制备同一小RNA家族 不同成员的功能丧失突变体。以突变体植株进行扩繁大量种子，是成功获得研究水稻 MIRNA393b基因功能的理想材料。迄今，尚未有敲除小RNA茎环序列的基因编辑方法和该水 稻突变体材料的报道。
【附图说明】
[0043] 图1为MIR393b基因结构和2个gRNA位点；
[0044]图2为第一轮PAGE凝胶电泳筛选出杂合突变体；
[0045] 图3为第二轮PAGE凝胶电泳筛选出纯合突变体；
[0046] 图4为突变株系目的片段测序结果的比较(黑色矩形表示缺失碱基，单下划线表示 插入碱基，双下划线表示替换碱基）；
[0047] 图5为纯合突变体miR393b前体表达水平的qRT-PCR检测。
【具体实施方式】
[0048]实施例1水稻MIRNA393b茎环序列敲除株系的获得与鉴定
[0049] 本发明所转水稻品种为日本晴（Ory za · Sa t i va L · spp · japon i ca，var Nipponbare)〇
[0050] 1. gRNA靶位点的选择
[0051 ]由于MIR393b基因位于水稻基因组的第四号染色体上，根据CRISPR-Cas9技术的设 计靶位点的原则，本发明把第一个靶位点设计在MIR393b基因的前体茎环序列上，第二个靶 位点在茎环序列下游3 '端。见图1。
[0052] 2. gRNA片段的克隆及载体构建
[0053] 2.1以质粒pGTR为模板，用PCR方法克隆三个片段L1、L2、L3部分重叠的片段，引物 序列如下：
[0054] L1F:cgggtctcaggcaggatgggcagtctgggcaacaaagcaccagtgg(如SEQ ID NO: 1 所不）
[0055] LlF:cgggtctcagcgttgggcttctgcaccagccggg(如SEQ ID NO:2所不）
[0056] L2F:taggtctccacgctagcacacgttttagagctaggaa(如SEQ ID NO:3所不）
[0057] L2R:cgggtctcattcctcaggccgtgcaccagccggg(如SEQ ID NO:4所不）
[0058] L3F:taggtctccggaaactagtgggttttagagctagaa(如SEQ ID N0:5所不）
[0059] L3R:taggtctccaaacggatgagcgacagcaaacaaaaaaaaaagcaccgactcg(如SEQ ID NO： 6所示）
[0060] PCR扩增L1片段体系如下：
[0061]
[0062] ~PCR扩增L2片段体系如下:
' '
[0063] PCR扩增L3片
体系如下：
[0064]
[0065] PCR反应程序为：预变性95°C5min;变性95°C30s、退火60°C30s、延伸72°C30s，共33 个循环。最后72°C延伸lOmin。
[0066] PCR反应后，取5-10μ1产物，用2%的琼脂糖凝电泳检测后进行纯化回收目的片段， 测定产物浓度。LI，L2，L3产物大小约为130bp，200bp，150bp。
[0067] 2.2进行66(81?熟11?熟)连接。
[0068] 按照上步测定