莱茵衣藻酰基辅酶a合成酶反义rna表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及调控调控绿藻分泌脂肪酸的酰基辅酶A 合成酶反义RNA表达载体及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 收集微藻和提取微藻内油脂的高昂成本一直阻碍微藻生物柴油的发展。随着分子 生物学的发展，可通过基因工程的方法调控微藻内油脂代谢相关基因，从而获得分泌脂肪 酸的高产油微藻。
[0003] 已有文章报道在酿酒酵母中敲除参与脂肪酸β_氧化的基因可导致细胞内自由脂 肪酸的产量上升且自由脂肪酸可分泌到细胞外。其中酰基辅酶Α合成酶可将脂肪酸活化成 与之对应的辅酶A硫脂底物，广泛参与油脂的代谢与合成途径。2003年Michinaka等人在部 分缺失ACS基因活性的酿酒酵母突变株中察到脂肪酸分泌的现象，2007年Black和DiRusso 对五株单独缺失ACS基因 （Δ faal，Δ faa2，Δ faa3，Δ faa4, Δ fatl)的突变株进行研究，均 观察到了微量的脂肪酸分泌现象。在此基础上，2008年Scharnewski等将酿酒酵母中的FAA1 和FAA4敲除，获得可向培养基中分泌脂肪酸的酵母突变株。C. Leber等在2014年通过基因工 程的手段获得联合沉默ACS基因 （Δ faal Δ faa4 Δ fat 1)的酿酒酵母突变株，发现此突变株 能分泌自由脂肪酸到培养基中，其浓度达到490mg/L。
[0004] RNA反义技术(Antisense RNA)是在体外设计特异性片段，构建人工表达载体，使 其在离体或生物体内表达反义的RNA，然后通过碱基互补配对与祀mRNA结合，形成稳定的二 聚体，在DNA的复制、转录和翻译水平上高度特异地抑制靶基因的表达，从而影响靶基因在 细胞内的功能。
[0005] RNA反义抑制基因表达的功能实现，依赖于反义RNA序列的选择与高效表达载体的 构建。本发明以莱茵衣藻为代表，分别针对两个莱茵衣藻ACS基因设计并获得合适的反义 RNA片段，构建反义RNA载体。运用该载体构建了具有该反义片段的莱茵衣藻基因工程藻株， 具有分泌脂肪酸功能的高产油绿藻。
【发明内容】
[0006] 针对上述存在问题，本发明提供一种特异抑制绿藻ACS基因表达的反义RNA表达载 体，该载体含有莱茵衣藻ACS基因的目的片段，通过珠磨法获得的对应转基因绿藻，可通过 光强或温度等手段调控，高效诱导沉默ACS的表达与翻译，减少脂肪酸的代谢，从而提高绿 藻脂肪酸合成，促进脂肪酸分泌。
[0007] 本发明公开了一种莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体，包括骨架载体和 反义RNA片段，以pH124为骨架，分别以莱茵衣藻的acsl和acs2两个ACS基因的部分片段为反 义RNA片段，通过双酶切方法将其反向插入pH124中，构建由Hsp70-Rb Cs2组合启动子控制的 两种反义RNA表达载体pH-acsl和pH_acs2,所述的两个acs基因的反义RNA片段序列分别为 Seq ID N0.1和Seq ID N0.2。
[0008]本发明还公开了一种基于权利要求1所述的莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表 达载体的构建方法，包括以下步骤：
[0009] 1)ACS基因目的片段的获得
[0010] 提取莱茵衣藻总1?祖，将其反转录为〇0嫩，以〇0嫩为模板，以369 10勵.3和369 10 N0.4为引物对莱茵衣藻acsl的目的片段进行PCR扩增，以Seq ID N0.5和Seq ID N0.6为引 物对莱茵衣藻acs2的目的片段进行PCR扩增，分别获得SEQ NO. 1和SEQ NO.2;
[0011] 2)酰基辅酶A合成酶的反义RNA载体构建
[0012] 将反义RNA片段SEQN0.l、SEQN0.2和载体pHl24分别用EcoRI和XhoI双酶切，并 分别将反义RNA片段连接到载体pH124对应的酶切位点上，使反义RNA片段反向插入载体上， 分别获得反义表达载体pH-acs 1和pH_acs2。
[0013] 其中，所述SEQN0.3、SEQN0.4、SEQN0.5以及SEQN0.6的序列号分别为：
[0014] SEQ N0.3:5'cggaattcGTCGGCGTCCGCGGCGGCGCC(EcoR 1)3'；
[0015] SEQ N0.4:5'ggggtaccATGGAGCCGGCCCGCCCGGCTGGT(Kpn 1)3'；
[0016] SEQ N0.5:5'cggaattcCACCGTCAGCATGGTGGGCAGCA(EcoR 1)3'；
[0017] SEQ N0.6:5'ggggtaccATGGCCCCGACAGCGGGG(Kpn 1)3'〇
[0018] 本发明还公开了一种基于权利要求1所述的莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表 达载体的应用，反义表达载体pH-acsl和pH-acs2通过光强或温度的诱导手段构建能够表达 反义RNA的可调控转基因工程藻，且该转基因工程藻调控绿藻分泌脂肪酸中的应用。
[0019] 其中，该反义RNA表达载体在应用过程中具有以下特征：
[0020] 1)反义表达载体pH-acsl和pH_acs2可被光强或温度诱导调控；
[0021 ] 2)反义表达载体pH-acsl可高效抑制acsl的表达与翻译，pH_acs2可高效抑制acs2 的表达与翻译；
[0022] 3)构建的能够表达反义RNA的可调控转基因工程藻调控细胞内脂肪酸代谢；
[0023] 4)构建的能够表达反义RNA的可调控转基因工程藻可分泌脂肪酸。
[0024]其中，运用反义表达载体pH-acsl和pH-acs2构建转基因工程藻的构建过程包括以 下步骤：
[0025] 1)构建茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表达载体pH-acsl和pH-acs2;
[0026] 2)采用珠磨法将pH-acsl和pH-acs2分别转入莱茵衣藻中；
[0027] 3)培养和筛选表达反义RNA的转基因莱茵衣藻。
[0028] 其中，表达反义RNA的转基因莱茵衣藻藻株分泌脂肪酸的调控方法包括以下步骤： [0029] 1)取对数生长末期的表达反义RNA的转基因莱茵衣藻藻株到100mL的新鲜TAP培养 基中，使其藻细胞初始浓度为1 .〇 X 105cells/mL，将藻转移到光照培养箱中培养，培养条件 为:光照为l〇〇yE/m2/s，温度为23°C ;
[0030] 2)藻细胞培养到第四天进入对数生长末期，对藻细胞进行水浴，40 °C热激30min， 将藻细胞转移到光照培养箱中恢复正常培养；
[0031] 3)藻细胞正常恢复培养2天后，收集藻细胞与培养基。
[0032]其中，用于转基因的植物莱茵衣藻藻株属微藻，具体为莱茵衣藻cc-849。
[0033]本发明还公开了一种基于权利要求1所述的莱茵衣藻酰基辅酶A合成酶反义RNA表 达载体的应用，其特征在于，反义表达载体pH-acsl和pH-acs2通过光强或热激的诱导手段 构建表达调控转基因藻的酰基辅酶A合成酶，该构建过程包括以下步骤：
[0034] 1)转基因受体藻的筛选与培养:采用TAP、BBM的绿藻培养基，在光照90~200μΕ/ m2/s的条件下通气培养莱茵衣藻；
[0035] 2)根据权利要求2的方法确定反义表达载体pH-acsl和pH-acs2的序列，体外扩增 反义RNA序列；
[0036] 3)构建绿藻表达载体:将反义RNA插入带有特异性启动子的绿藻表达载体；
[0037] 4)表达载体的遗传转化与转基因藻的筛选:将带有反义RNA序列的表达载体，通过 "珠磨法"进行遗传转化，通过抗性平板筛选获得阳性藻落，进行分子检测和表达产物分析， 确定获得的转基因藻能通过诱导的方式稳定调控反义RNA表达。
【附图说明】
[0038] 图1.PCR获得siacsl和siacs2核酸片段的电泳图；
[0039] M：DNA maker DL2000
[0040] l:siacsl PCR产物
[0041] 2:siacs2 PCR产物；
[0042] 图2.1'1-81&。81、1'1-81&。82和口!1124双酶切电泳图；
[0043] M：DNA maker DL5000
[0044] l:Tl-siacsl 双酶切产物
[0045] 2:Tl-siacs2 双酶切产物
[0046] 3:质粒Tl-siacsl;
[0047] 图3.反义表达载体pHl 24-acs 1和pHl 24_acs2中反义片段PCR检测电泳图；
[0048] M：DNA maker DL5000
[0049 ] 1: s iacs 1PCR产物，模板为质粒pHl 24-acs 1
[0050] 2: siacs2PCR 产物，模板为质粒 pH124-acs2;
[0051 ] 图4.转基因藻中siacsl/siacs2的PCR鉴定电泳图；
[0052] M：DNA maker DL5000
[0053] l:siacslPCR产物，模板为莱茵衣藻siacsl基因组
[0054] 2: siacs2PCR产物，模板为莱茵衣藻siacs2基因组；
[0055] 图5.转基因藻siacsl中的acslmRNA的表达量；
[0056] 图6.转基因藻siacs2中的acs2mRNA的表达量；
[0057]图7.藻细胞内脂肪酸含量；
[0058] cc849:野生型，siacsl:转入pHl24-acs 1的莱茵衣藻转化子，siacs2:转入pHl24-acs2的莱茵衣藻转化子，**:表不与cc849相比产生极显著性差异(P〈0.01)
[0059] 图8.培养基中脂肪酸含量；
[0060] cc849:野生型，siacsl:转入pHl24-acs 1的莱茵衣藻转化子，siacs2:转入pHl24-acs2的莱茵衣藻转化子，*:表不与cc849相比产生显著性差异(P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0061] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0062] 实施例1
[0063]转基因受体藻的选择与培养
[0064] 选择细胞壁缺陷型莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，cc-849，购自美国 Duck大学衣藻遗传中心）作为转基因的受体藻株，其培