制性酶切后，将产物纯化试剂盒纯 化后的酶切产物，与用相同酶切的pGAPZa Α载体（Invitrogen Co.，Ltd.)连接，连接反应 体系如下：
[0022]
[0023] 以上混合物22°C连接4小时。所得连接产物转化E. coli DH5 α感受态细胞，涂 布博来霉素抗性平板，筛选阳性克隆，利用质粒提取试剂盒制备质粒DNA。所得质粒DNA用 Ncol和Spel双酶切初步鉴定出质粒pGAPH。
[0024] 实施例2表达质粒pGAPH-EG27I的构建
[0025] 首先设计以下引物对：
[0026] 上游：5' -GGCACTAGTGCTTTGGCTGCACAGTTGTGTCAG-3'
[0027] 下游：5' -CGCTCTAGATTAGCCCGAATTGTGGCATTCAC-3'
[0028] 以 pPIC9K-eg27I[Rui Guo et al. Acta Biochim Biophys Sin, 2008:419-425] 为模版，采用以上引物对，PCR扩增得到EG27I的基因，产物纯化回收目的片段后，用 Spel和Xbal酶切回收，与相同酶切的pGAPH质粒相连接，连接条件同实施例1，得到质粒 PGAPH-EG27I，其结构示意图如图1所示，其核心区域包含了 GAP启动子，Kozak序列，HFBII 信号肽以及目的基因 EG27I。连接产物转化E. coli DH5a感受态细胞，涂布博来霉素抗性 平板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA，所得质粒DNA用Spel和Xbal双酶切来鉴 定重组质粒PGAPH-EG27I。将双酶切鉴定正确的质粒进行测序鉴定，鉴定结果正确的即为重 组质粒 PGAPH-EG27I。
[0029] 实施例3表达质粒转化毕赤酵母SMD1163
[0030] 将构建的重组表达质粒PGAPH-EG27I用Blnl酶切线性化，酚/氯仿抽提回收并溶 解于无菌水中。按Invitrogen手册介绍的方法[Invitrogen corp S D，CA.A manual of methods expression of recombinant proteins in pichia pastoris, 1998]制备SMD1163 电转化细胞，将上述10 μ g线性化质粒与80 μ 1电转化细胞混合，采用Bio-Rad电转化仪 电击转化，电转化采用电转仪预设的酿酒酵母的电转化条件。电转化产物转移到l〇ml无菌 离心管中，立即加入lml0°C预冷的lmol/L山梨醇，30°C静置两小时，加入2ml YPD(10g/L Yeast Extract, 20g/L Tryptone，20g/L D-glucose)后 30°C保温过夜。第二天快速离心去 除上清，加入100 μ 1无菌水重悬菌体。取100 μ 1涂布不同浓度博来霉素的YPD平板，30°C 培养72小时左右，提取阳性克隆基因组利用上述引物对进行PCR鉴定，鉴定结果正确的即 为EG27I的毕赤酵母重组表达菌株pGAPH-EG27I/SMD1163。
[0031] 实施例4EG27I在毕赤酵母中的表达
[0032] 将筛选出的EG27I重组表达菌株pGAPH-EG27I/SMD1163接种3ml YTO培养基， 30°C、250rpm摇床中培养过夜，以1 %接种量接种至8瓶含有250ml YH)培养基的1L锥形 瓶中，30°C、250rpm培养过夜，之后将8瓶过夜培养物接种至含有30L Fermentation Basal Salts Medium的50L发酵罐中培养，接种前在发酵培养基中补加4. 35ml/L的PTMi，培养温 度为30°C，pH控制在5. 0,转速500rpm，通气量lvvm。
[0033] 待发酵罐中溶氧量由100%下降到0%之后回升时，开始向发酵罐中补加50%甘 油（含4ml/L)的PTMi，补料速度与溶氧联动，通过补料将溶氧控制在20%左右。发酵过程 中每隔12小时取样，将发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，上清液中含 有重组纤维素酶，且随着发酵时间的延长而不断积累。同时，测定各时间点发酵液在600nm 处的吸光度值和上清中的酶活力。各取样点的测量值如图3所示，随着发酵时间的增长，菌 体量与重组纤维素酶的表达量逐步上升，至100小时左右进入平台期，发酵过程中，上清中 的最高酶活力为1259U/L，约合54. 9mg/L的EG27I。
[0034] 本发明的优点在于构建了一种新型的表达质粒pGAPH，利用该质粒构建的重组毕 赤酵母可高效表达福寿螺内源性纤维素酶EG27I。
[0035] 本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的 方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等 价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中 描述的本发明进行各种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本 说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征 中的任何2个或更多个的任何和所有组合。
【主权项】
1. 表达质粒pGAPH的构建方法，其包括如下步骤：(a)制备如下的dsDNA :5' -ACTCAAT TGAACAACTATTTCGCCACCATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCTGAATTCGGTACCA AT-3';和（b)Mfel和ΚρηΙ双酶切上述dsDNA并回收产物，将所述回收产物与经过相同酶切 的pGAPZ α A载体相连，得到pGAPH质粒。2. 质粒，其是可根据权利要求1所述的方法构建的质粒pGAPH。3. 根据权利要求2所述的质粒，其进一步含有福寿螺内源性纤维素酶EG27I的编码序 列。4. 根据权利要求3的质粒，其是通过将EG27I基因与pGAPH质粒相连接而获得。5. 如权利要求2 - 4中任一项所述的质粒，其特征在于，该质粒起始密码子上游有一 段 Kozak 序列 5' -GCCACC-3'，之后是分泌信号肽 ATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAG TGCTTTGGCT。6. 工程菌株，其包含根据权利要求2 - 4中任一项的质粒。7. 根据权利要求6的工程菌株，其为DH5 α工程菌株。8. 工程菌株，其被根据权利要求3或4的质粒转化。9. 根据权利要求8的菌株，其是SMD1163。10. 生产福寿螺内源性纤维素酶的方法，其包括培养根据权利要求8或9的菌株。
【专利摘要】本发明涉及福寿螺内源性纤维素酶EG27I在毕赤酵母中的组成型表达与纯化。本发明通过福寿螺内源性纤维素酶EG27基因的重组表达质粒的构建获得了在巴斯德毕赤酵母(Pichia？pastoris)中的组成型高表达和纯化福寿螺内源性纤维素酶EG27I方法。
【IPC分类】C12N15/63, C12R1/84, C12N9/42, C12N1/19, C12N1/21, C12N15/66, C12R1/19
【公开号】CN105647949
【申请号】
【发明人】陈玮, 耿新伟, 付彩云, 赵辅昆, 吴程雨, 张柏超, 倪楠
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年12月8日