b)共同孵育4个小时之 后，IFN-γ分泌水平的检测，采用BD CBA assay kit。以K562和相应抗体孵育作为对照组， 其结果如图7所示。
[0119] 结果显示，FcyRIIIa-BB^对Raji、SK0V3和ΑΝΤΙ三种细胞，在相应的抗体0.1μg/ml 共同孵育的情况下，其细胞因子IFN-γ的分泌水平都明显高于FcyRHIa-⑶8α-ΒΒ-ζ组。
[0120] 实施例9Fc γ Rma-ΒΒ-ζ慢病毒感染ΝΚ92试验
[0121] ΝΚ92本身无 CD16a的表达，采用？〇丫1?111&-88气转导疆92细胞系，以未转染疆92作 为对照，从而验证Fey Rma-ΒΒ-ζ的特异性杀伤能力。其中NK92无 ADCC作用能力，该实验用 于直接证明该CAR分子设计的优势。
[0122] NK92细胞参考ATCC说明进行培养，10M0I Fc yRina-BB-G慢病毒感染培养的NK92 细胞，以未转染的NK92细胞作为对照，和抗体共同孵育研究对Raji细胞（CD20+， rituximab)、SK0V3细胞（Her2+，trastuzumab)、ΑΝΤΙ细胞（CCR4+，mogamulizumab)的杀伤能 力。NK92细胞本身缺失FcyRHIa的表达，其结果如图8所示。
[0123] 经过对照试验确切说明嵌合Fc γ Rma-ΒΒ-ζ基因的NK92细胞具有ADCC的杀伤能 力；结果还显示，相对于未转染的ΝΚ92细胞，表达嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ的ΝΚ92细胞的杀 伤能力明显提高，说明ΝΚ92细胞通过嵌合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ的ADCC作用起到针对性的杀 伤作用。
[0124] 实施例lOFc γ Rma-ΒΒ-ζ-NK的制备方法(用于异基因治疗的产品化细胞制剂）。
[0125] 1、采用IL-15、IL-21细胞因子培养法从PBMC培养ΝΚ细胞，经过14到21天的培养，ΝΚ 细胞纯度达90%以上；
[0126] 2、收获培养的NK细胞，DPBS洗涤三遍；
[0127] 3、加入生理盐水重悬，调整细胞浓度为5X107/ml，加入O.Uig/ml治疗性单克隆抗 体，4°C孵育45分钟；
[0128] 4、1500rpm，10min离心收集抗体孵育后的细胞，加入含有10%DMS0的细胞冻存液， 调整细胞浓度为5X107/ml，置于细胞冻存袋中，超低温冰箱过夜后转移到液氮中保存；
[0129] 5、需要回输该细胞时，液氮或者干冰运输到回输地，在37°C水浴锅中快速解冻，之 后回输回患者体内；
[0130] 6、冻存复苏后细胞功能验证:细胞活率和杀伤能力试验，其结果如图9-10所示。
[0131 ]图9显示，冻存复苏后细胞活率略有下降，仍能达到90 %以上的细胞活率，能够满 足临床治疗的需要。
[0132] 图10显示，冻存复苏后的NK细胞依旧保留了单克隆抗体的ADCC作用能力，细胞杀 伤能力略有下降，细胞杀伤能力水平能够满足临床治疗的需求。复苏后可以直接回输患者， 能够起到结合治疗性单克隆抗体的ADCC作用。
[0133] 通过上述实施例可以看出，本发明在优化CAR分子结构的基础上，设计的作用位点 为Fc γ Rma的CAR分子，其采用将Fc γ Rma细胞外区域直接与⑶8α跨膜区域连接，删除了 CD8a铰合区的独特设计，不仅可与多种不同的单克隆抗体药物联合使用，用于多种肿瘤的 治疗，同时与含有CD8a铰合区的结构相比，其更有利于激活效应细胞，能更进一步发挥CAR 分子对肿瘤细胞的高效杀伤功能；同时，该设计的嵌合Fc γ Rma基因的免疫细胞，体外扩增 后回输患者体内，补充有功能的ADCC效应细胞，在单克隆抗体药物的介导下特异性识别肿 瘤细胞，同时通过CAR分子起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0134] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并 不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所 属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换 以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0135] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0136] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0137] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种基于Fc γ Rma的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因包括依次串联的Fc γ Rm a信号肽、Fc γ Rma细胞外区域、⑶8α跨膜区域和胞内信号传导结构域，所述Fc γ Rma细胞 外区域直接与CD8a跨膜区域连接。2. 根据权利要求1所述的嵌合基因，其特征在于，所述Fey Rma信号肽具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO: 3所示； 优选地，所述Fey Rma细胞外区域具有如SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列，其编码基因 序列如SEQ ID NO:4所示； 优选地，所述⑶8α跨膜区域具有如SEQ ID N0:10所示的氨基酸序列，其编码基因序列 如SEQ ID NO:5所示。3. 根据权利要求1或2所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因还含有Kozak序列； 所述Kozak序列如SEQ ID NO:2所示； 优选地，所述胞内信号传导结构域由共刺激分子和细胞活化信号拼接而成； 优选地，所述共刺激分子为 CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、LFA-1、 ⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或⑶83中的任意一种或至少两种的组合，优选为⑶28或4-1BB 中的任意一种或两种的组合，进一步优选为4-1BB; 优选地，所述4-lBB具有如SEQIDN0:ll所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQID NO: 6所示； 优选地，所述细胞活化信号为CD3G信号传导结构域； 优选地，所述CD3G信号传导结构域具有如SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列，其编码基 因序列如SEQ ID NO:7所示。4. 根据权利要求1-3之一所述的嵌合基因，其特征在于，所述嵌合基因是由Kozak序列、 Fc γ Rma信号肽、Fc γ Rma细胞外区域、CD8a跨膜区域、共刺激分子和⑶3ζ信号传导结构域 依次串联拼接而成，所述FcyRHIa细胞外区域直接与CD8a跨膜区域连接，不含有CD8a铰合 区； 优选地，所述嵌合基因具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。5. -种重组表达载体，其包含如权利要求1-4之一所述的嵌合基因。6. -种细胞，其表达如权利要求1-4之一所述的嵌合基因或含有如权利要求5所述的重 组表达载体； 优选地，所述细胞为T细胞、NK细胞或DC细胞中的任意一种； 优选地，所述T细胞为中心记忆T细胞、效应记忆T细胞或效应T细胞中的任意一种； 优选地，所述NK细胞为原代培养的NK细胞或NK92细胞系。7. 根据权利要求6所述的细胞在制备预防和/或治疗和/或辅助治疗恶性肿瘤或者病毒 感染性疾病的药物中的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述细胞与单克隆抗体联合使用； 优选地，所述单克隆抗体为CD20、CD52、Her-l/2、EGFR、VEGF、CD117或ro-l中的任意一 种或至少两种的混合物。
【专利摘要】本发明涉及一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途，所述嵌合基因包括依次串联的FcγRⅢa信号肽、FcγRⅢa细胞外区域、CD8α跨膜区域和胞内信号传导结构域，所述FcγRⅢa细胞外区域直接与CD8α跨膜区域连接；本发明通过将FcγRⅢa细胞外结构域直接与CD8α跨膜区连接，删除了常规嵌合抗原受体(CAR)分子设计中的CD8α铰合区，使得该种FcγRⅢa-CAR分子更有利于激活效应细胞，显著提高了FcγRⅢa-CAR分子对肿瘤细胞的杀伤能力；该种设计的FcγRⅢa-CAR分子与单克隆抗体药物联合可通用于多种肿瘤的细胞治疗。
【IPC分类】A61K38/17, A61P31/12, C12N15/63, C12N5/10, A61K45/06, A61P35/00, C12N15/62
【公开号】CN105647946
【申请号】
【发明人】孙振华
【申请人】苏州康元生物科技有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月18日